高轉(zhuǎn)化效率釀酒酵母VL6-48((ATCCno.MYA-3666)因TRP1基因缺失而不能在Trp缺陷培養(yǎng)基中生長。因此TRP1基因可用作一個選擇標記。對該菌株，HIS3基因也可作為選擇標記URA3基因作為標記。不推薦直接做克隆實驗，盡管該菌株是URA3基因缺陷(The URA3gene on its chromosome is inactivated but not deleted, and thus unwanted recombination occurs at relatively high frequency between chromosomal URA lociand the URA gene on the vector)

基因型為:MATalphahis3-D200trpl-Dura3-52lys2ade2-10met4psi+cir0

操作方法:

1.取100uL冰上融化的VL6-48感受態(tài)細胞，依次加入預冷的目的質(zhì)粒2-5ugCarrier DNA(95100℃5min快速冰浴重復一次)10uLPEG/LiAc500uL 并吸打幾次混勻30℃水浴30min(15 min 時翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻 )。

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2.將離心管放42℃水浴15min(7.5min 時翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻)。

3.5000rpm離心40s棄上清，ddH400uL重懸，離心30s棄上清。

4.ddHo50-100uL重懸涂板，29℃培養(yǎng) 48-96h

注意事項:

1.感受態(tài)細胞zuihao在冰上融化

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌最

3.同時轉(zhuǎn)化 2-3 種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。

4.一般釀酒酵母菌株對高溫敏感，zuishi生長溫度為27-30℃;高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5.菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現(xiàn)象。當細胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用。然而，有些菌株的 ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE578基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物 P-ribosvlamino imidazole(AIR)在細胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色

6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例:涂YPDA 平板 29℃48h培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆涂SD 單缺平板29℃.48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm 克隆。