DH10B-Plus 電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。DH10B-Plus菌株來源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10B-Plus菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA(無論真核生物還是原核生物的基因組DNA都能被高效的轉(zhuǎn)入DH10B-Plus中)。recA1和 endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。中80dlacZM15標(biāo)記的存在使DH10B-Plus可用于藍(lán)白斑篩選，rpsL賦予其lianmeisu抗性。DH10B-Plus感受態(tài)細(xì)胞

適用于大質(zhì)粒的構(gòu)建或者各種文庫構(gòu)建，經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>10cfu/μgDNA

基因型為:F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) ф80lacZΔM15ΔlacX74recAlendAl araD139A(ara,leu)7697 galE15 galK λ-rpsL nupG Hte(Tet)

操作方法:

1.0.lcm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5min,待其瀝千水分,正置5min,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5min充分降溫。

2.取-70℃保存的DH10B-Plus電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5min,待其融化,加入目的DNA(質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手boda離心管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。

A.測定轉(zhuǎn)化效率使用1μl 0.1ng/μl的對照質(zhì)粒pUC19;B.對于連接產(chǎn)物,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液(10mM Tris-HCl.pH7.5;1mMEDTA)重懸,DNA濃度不超過100ng/μ,體積不超過5μl/50μl感受態(tài)。3.用 200μl 槍頭將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。4.啟動電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25μF,PC=200Ω,V=1.8kV(BioRad電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù));或C=25μF,PC=200Ω,V=2.4kV(BTX ECM 630或Bio-Rad GenePulser電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù));也可按所用電轉(zhuǎn)儀推

薦的參數(shù)操作。將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。5.2min 后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700μl不含抗生素的無菌S.O.C.培養(yǎng)基(室溫),用1ml

槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50ml離心管(BD Falcon 50ml錐形離心管等),向離心管中補(bǔ)加S.O.C.培養(yǎng)基至5ml。37C,225rpm 復(fù)蘇60min。

6.5000rpm 離心 1min收菌,重懸后取 100-200μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm 培養(yǎng)皿2-5個(gè))。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng) 13-17h。