百螢——Annexin V-iFluor 594標記實驗方案

時間：2023/6/9閱讀：49

Annexin V-iFluor 594標記是美國AAT Bioquest研發(fā)的用于檢測細胞功能的探針，膜聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結合蛋白家族。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質的Annexin V-iFluor 594檢測試劑。

實驗方案

分析方案

概述

用測試化合物（200μL/樣品）制備細胞

添加Annexin V結合物測定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞：

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導細胞凋亡。

1.3離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。

1.4將細胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。

1.5在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結合物。

可選：在細胞內加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

1.7在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。

1.8使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。

2.使用流式細胞儀分析：

通過使用具有適當過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V結合流式細胞術分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。然而，Casiola-Rosen等人先前報道了利用膜聯(lián)蛋白V對貼壁細胞類型進行流式細胞術的方法。和van Engelend等。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1移取步驟1.6的細胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細胞。將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。在玻璃載玻片上翻轉蓋玻片并觀察細胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞

數(shù)據(jù)分析

下圖是使用流式細胞儀檢測膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰*氨酸在Jurkat細胞凋亡中的結合活性的實例。在活的非凋亡細胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450檢測非誘導細胞中的先天性細胞凋亡，其通常為所有細胞的2-6％。在凋亡細胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰*氨酸結合，磷脂酰*氨酸位于細胞膜的外部小葉上，導致染色強度增加。

Annexin V-iFluor 594實驗圖.png

圖1.在Jurkat細胞中檢測膜聯(lián)蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰*氨酸的結合活性。將Jurkat細胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中不用（藍色）或用1μM星形孢菌素（紅色）處理5小時，然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分鐘。使用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式細胞儀，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下測量膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450的熒光強度。

光譜：

光譜性質

　　 吸光度; 587

　 校正因子：0.05

　 校正因子：0.04

　　消光系數(shù)：1800001

　　激發(fā)(nm)：588

　　發(fā)射(nm) ：604

　　量子產(chǎn)率：0.531