Cy(Cyanine),也叫花青染料，是一系列在實驗中很常見的熒光化合物。跟著百螢一起看看它們是怎么工作的吧！
1.問：Cy3、Cy5、Cy7是什么？光譜特性如何？適用于哪些應用？
答：Cy3、Cy5和Cy7是一類熒光染料，常用于生物科學研究中的熒光標記和成像。它們屬于氰化染料家族，可以在特定波長下吸收光能，并在不同波長下發(fā)射特定顏色的熒光信號。
Cy3的最大吸收波長約為550納米，最大發(fā)射波長約為570納米；Cy5的最大吸收波長約為650納米，最大發(fā)射波長約為670納米；Cy7的最大吸收波長約為750納米，最大發(fā)射波長約為770納米。
Cy3、Cy5和Cy7廣泛應用于分子生物學和細胞生物學研究中的熒光標記。它們常用于熒光顯微鏡觀察、流式細胞術(shù)、免疫熒光染色、蛋白質(zhì)和核酸定量等實驗中。
2.問：Cy3NHS酯在動物活體實驗中的注意事項有哪些？
答：(1)Cy3標記物在使用前需要稀釋到合適的濃度和pH值。一般推薦使用PBS或TBS緩沖液稀釋，避免使用含有氨基或巰基的緩沖液或添加劑，以防止與Cy3發(fā)生反應或還原。Cy3標記物的稀釋比例根據(jù)實驗目的和條件而定，一般在1:200-1:1000之間。
(2)Cy3標記物在使用過程中需要避免光照和高溫，以防止熒光淬滅或降解。Cy3標記物可以在4°C避光保存數(shù)月，或者在-20°C避光保存數(shù)年。如果需要凍存，可以加入適量的甘油或DMSO作為凍存保護劑。
(3)Cy3標記物在動物實驗中可以用于尾靜脈注射，進行活體成像。每次注射200μL(濃度0.5 mg/mL)，每5分鐘記錄一張動物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片，分析熒光藥物的分布情況。對照鼠不注射藥物，進行同時記錄。
3.問：磺化和非磺化的Cy3有什么區(qū)別？哪個更適合蛋白染色？
答：磺化的Cy3和非磺化的Cy3的主要區(qū)別是水溶性和標記方法?；腔腃y3在發(fā)色團上有兩個硫酸離子官能團，所以它的水溶性很高，可以直接在水溶液中進行標記反應，不需要有機溶劑助溶1。非磺化的Cy3的水溶性較低，需要預先溶解在有機溶劑(如DMF或DMSO)中，然后加入到生物分子的水溶液中反應。如果被標記的蛋白質(zhì)對有機溶劑敏感，或者需要通過透析純化，那么磺化的Cy3是更好的選擇。另外，磺化的Cy3也有更好的光學穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率，發(fā)出的熒光更強更耐光照。兩種Cy3的熒光譜圖幾乎一樣，只是磺化的Cy3有微小的藍移。因此，在大多數(shù)情況下，兩種Cy3可以相互替換使用。百螢生物提供多種基團的Cy染料，歡迎選購
4.問：Cy3標記植物組織和動物組織，在實驗操作上有什么區(qū)別？
答：Cy3標記植物組織和動物組織在操作上的區(qū)別可能取決于不同的實驗目的和方法，但是一般來說，有以下幾點需要注意：
(1)植物組織通常有較厚的細胞壁，可能影響染料的滲透和結(jié)合。因此，在標記前可能需要用酶或機械方法處理植物組織，增加其滲透性；
(2)植物組織和動物組織的pH值可能不同，這可能影響染料的穩(wěn)定性和熒光強度。因此，在選擇緩沖液時，需要考慮目標組織的pH值，并且避免使用含有氨基的緩沖液，如Tris或甘an酸，以免與染料競爭反應；
(3)Cy3染料有脂溶性和水溶性兩種類型，脂溶性染料需要加入有機溶劑助溶，而水溶性染料不需要，水溶性染料通常更穩(wěn)定，更適合標記對有機溶劑敏感的生物分子；
(4)Cy3染料可以與生物分子上的氨基反應形成穩(wěn)定的酰胺鍵，因此在標記時需要控制反應條件和比例，以達到理想的標記效率和熒光信號。一般來說，Cy3染料與目標分子的摩爾比在4-12之間為宜。
5.問：Cy5 馬來酰亞胺能否標記外泌體？如何操作？
答：Cyanine 5 maleimide是一種熒光染料，常用于對含有巰基的蛋白質(zhì)或肽鏈進行標記。該產(chǎn)品可以標記外泌體，以下是一般的標記步驟：
(1)準備外泌體樣品：收集并純化外泌體樣品，確保樣品的純度和完整性。
(2)選擇適當?shù)木彌_液：根據(jù)實驗需求選擇合適的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)。
(3)制備Cyanine 5 maleimide工作溶液：根據(jù)說明書，將Cyanine 5 maleimide溶解在適當?shù)娜軇┲?，制備成工作濃度的溶液?br />
(4)反應標記：將外泌體樣品與Cyanine 5 馬來酰亞胺工作溶液混合，使其反應。反應時間和溫度可以根據(jù)實驗需求進行優(yōu)化，一般在室溫或較低溫下進行。
(5)反應停止：添加還原劑(如二巰基乙醇)以停止反應，并消除未反應的Cyanine 5 馬來酰亞胺。
(6)清洗和去除未結(jié)合的染料：使用適當?shù)南礈炀彌_液，如PBS，對標記后的外泌體樣品進行洗滌，以去除未結(jié)合的染料。
(7)分析和評估：使用熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)或其他適當?shù)募夹g(shù)，對標記后的外泌體樣品進行熒光檢測和分析。
參考文獻：Pishesha, N.; Harmand, T.; Smeding, L.; Ma, W.; Ludwig, L.; Janssen, R.; Islam, A.; Xie, Y.; Fang, T.; McCaul, N.; Pinney, W.; Sugito, H.; Ploegh, H. Single domain antibody-antigen adducts that target Class II MHC induce antigen-specific tolerance. Research Square, preprint. doi: 10.21203/rs.3.rs-192181/v1
6.問：Cy3酸和NHS酯有什么區(qū)別？適用性有什么不同？
答：Cy3 acid(貨號140)和NHS酯(貨號141)都是一種黃色熒光染料，用于標記生物分子中的氨基。它們的區(qū)別在于反應基團的不同。Cy3 acid是一種羧酸，可以與活化劑(如EDC)反應，形成活化羧酸，再與氨基反應。Cy3 NHS酯是一種N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS酯)，可以直接與氨基反應，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。
Cy3 acid和NHS酯的適用性也有不同。Cy3 acid可以用于標記含有羧基的分子，如核酸，通過轉(zhuǎn)化為NHS酯或其他活化形式。Cy3 NHS酯可以用于標記含有氨基的分子，如蛋白質(zhì)，多
肽，或氨基修飾的核苷酸。Cy3 NHS酯比Cy3 acid更方便使用，因為不需要額外的活化步驟。
7.問：Cy3馬來酰亞胺常用于什么染色？它和Cy3NHS酯的區(qū)別是什么？
答：Cy3馬來酰亞胺(貨號142)常用于標記含有巰基的生物分子，比如半胱an酸和雙硫鍵等，然后用熒光顯微鏡或熒光酶標儀觀察或檢測它們的熒光信號。它和Cy3NHS酯(貨號141)的區(qū)別主要在于：
(1)Cy3馬來酰亞胺可以和巰基反應，而Cy3NHS酯可以和胺基反應。
(2)Cy3馬來酰亞胺的標記反應比Cy3NHS酯的標記反應更快、更高效、更特異。
(3) Cy3馬來酰亞胺的水溶性較低，需要使用有機共溶劑，而Cy3NHS酯的水溶性較高，不需要使用有機共溶劑。
8.問：Cy3NHS酯和Cy3雙NHS酯在蛋白染色方面有什么區(qū)別？
答：在染色方面的區(qū)別主要是：
Cyanine 3 雙NHS酯(貨號138)含有兩個NHS基團，可以與兩個氨基反應，形成雙綴合物。這種染料可能會在一些蛋白質(zhì)上產(chǎn)生更高的熒光信號，但也可能會增加非特異性結(jié)合的風險。
Cyanine 3 NHS酯(貨號141)含有一個NHS基團，只能與一個氨基反應，形成單綴合物 。這種染料是一種常用的染料，可以與多種生物分子發(fā)生共價結(jié)合，但也可能會降低熒光信號的強度。
對于Cyanine 3 雙NHS酯，常用于標記含有多個氨基的生物分子，如多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸等，也可以用于高靈敏度的熒光檢測，因為Cyanine 3 雙NHS酯在與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光大幅度增強。
Cy3 雙NHS酯注意事項：
(1)避免與含有羧基或硫醇基的生物分子反應，因為這些基團可能會與NHS基團競爭，導致非特異性結(jié)合或副反應。
(2)避免在強酸或強堿的條件下使用，因為這些條件可能會破壞染料的結(jié)構(gòu)或熒光性能。
9.問：Cy3酰肼可以用于哪些應用領域？
答：Cyanine 3 酰肼(貨號146) 可以與含有醛基或酮基的分子反應，形成穩(wěn)定的酰肼鍵。這種染料可以用于標記經(jīng)過過氧化物酶氧化后的抗體和其他糖蛋白，或者標記受到氧化應激或脫氨作用的蛋白質(zhì)，或者標記還原性的糖類。Cy3 NHS酯(貨號141)可以與含有氨基的分子反應，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。這種染料可以用于標記多肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸中的氨基末端或伯胺。如果需要該類產(chǎn)品進行蛋白/抗體染色，請根據(jù)目標的反應基團和功能基團，按
需選擇。
10.問：Cy3NHS酯標記蛋白或抗體后，如何高效純化？
答：(1)(實驗常用)用凝膠過濾層析法：將標記反應液通過大小孔徑合適的凝膠過濾柱，用適當?shù)木彌_液洗脫，收集流出液中的Cy3-蛋白標記物，并測定蛋白濃度和熒光強度。這種方法簡單快速，但可能會造成一些蛋白損失或稀釋。
(2)用逆相高效液相色譜法(RP-HPLC)：將標記反應液通過逆相C18柱，用不同比例的水和有機溶劑(如乙腈或甲醇)作為流動相進行梯度洗脫，收集適當?shù)纳珟Х?，冷凍干燥后得到Cy3-蛋白標記物。這種方法可以有效地分離和純化Cy3-蛋白標記物，但需要專業(yè)的儀器和操作技術(shù)。
(3)用親和層析法：如果待標記的蛋白具有特定的親和性，可以利用親和層析法進行純化。例如，如果待標記的蛋白是抗體，可以用蛋白A或蛋白G柱進行純化；如果待標記的蛋白是GST融合蛋白，可以用gu胱甘肽柱進行純化。這種方法可以保留蛋白的活性和穩(wěn)定性，但需要特定的親和配體和緩沖液。
11.問：Cy3鏈霉親和素和Cy3NHS酯在蛋白的標記方面有何區(qū)別？
答：Cy3鏈霉親和素(貨號16912)是一種將Cy3熒光染料與鏈霉親和素(streptavidin)結(jié)合的偶聯(lián)物，可以用于檢測生物su化的生物分子，例如抗體、配體或DNA探針。
它可以用于間接標記法，即先用生物su化的一級抗體或其他生物su化的探針與目標蛋白結(jié)合，然后用Cy3鏈霉親和素與生物su結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號。
Cy3鏈霉親和素的操作方法取決于所使用的生物su化探針的類型和濃度，一般來說，需要先將樣品與生物su化探針孵育，然后用PBS或其他適當?shù)木彌_液洗滌去除多余的探針，再加入適量的Cy3鏈霉親和素孵育，最后再次洗滌去除多余的偶聯(lián)物，就可以進行熒光檢測了。
12.問：Cy3疊氮化物和炔烴有什么關(guān)系？這兩個產(chǎn)品如何標記蛋白？
答：Cy3炔烴(貨號144)和疊氮化物(貨號143)可以在銅催化下發(fā)生[3+2]環(huán)加成反應，生成1,4-二取代的1,2,3-三唑衍生物，這種衍生物是Cy3染料的一種形式。
這種反應屬于點擊化學的范疇，因為它是高效、選擇性和正交的，即它不會受到其他官能團的干擾，也不會產(chǎn)生副產(chǎn)物。
Cy3炔烴和疊氮化物可以用來標記蛋白的方法是，將含有Cy3炔烴的蛋白和含有疊氮化物的標記分子(如抗體或其他配體)在銅催化下發(fā)生點擊化學反應，形成穩(wěn)定的三唑連接，從而實現(xiàn)蛋白的熒光標記。
這種方法的優(yōu)點是，它可以在溫和的條件下進行，不會破壞蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，而且反應選擇性高，不會受到其他官能團的干擾。 另外，Cy3染料是一種亮度高，熒光穩(wěn)定，對pH不敏感的橘黃色熒光染料，它可以用532 nm激光線激發(fā)，并用TRITC濾光片組觀察。
13.問：Cy3 TCO是什么？它與Cy3 NHS相比有什么區(qū)別？
答：Cy3反式環(huán)辛烯 [Cy3 TCO](貨號900)是一種熒光染料，可以與四唑類化合物發(fā)生快速的點擊反應，形成穩(wěn)定的共軛物。Cy3 TCO的優(yōu)點是反應速度快，無毒，適用于多種生物體系。缺點是染料分子較大，可能影響標記分子的活性或穩(wěn)定性。
Cy3反式環(huán)辛烯 [Cy3 TCO]和Cy3 NHS酯 [Cy3 NHS]是兩種不同的熒光染料，它們都可以用于標記含有氨基的生物分子，但是它們的反應機制和條件有所不同。Cy3 TCO是一種點擊化學試劑，它可以與四唑類化合物發(fā)生快速的無副產(chǎn)物的環(huán)加成反應。這種反應可以在水相或有機相中進行，不受pH、溫度、緩沖液等因素的影響。Cy3 NHS酯是一種活化酯試劑，它可以與氨基形成酰胺鍵3。這種反應需要在pH 7-9的緩沖液中進行，且受到水解、氨基競爭等因素的影響。因此，Cy3 TCO比Cy3 NHS酯具有更高的反應效率和選擇性，更適合標記活性或穩(wěn)定性較低的生物分子。所以如果需要標記含氨基的生物分子，選擇不止Cy3NHS酯，Cy3 TCO也許是您實驗的更優(yōu)良選擇，考慮自己的實驗條件，選擇最佳產(chǎn)品，可以事半功倍。
14問：Cy3四嗪是什么？它與其他常見的Cy3染料有何不同？
答：Cy3 tetrazine(貨號910)和其他Cy3染料的主要區(qū)別在于它們的反應基團和反應方式。Cy3 tetrazine是一種帶有四唑基團的熒光探針，它可以與TCO(反式-環(huán)辛烯)或其他應力烯烴發(fā)生特異性的點擊化學反應，形成穩(wěn)定的生物結(jié)合物。這種反應具有快速、高效、無毒和無銅的優(yōu)點。
15.問：PE-Cy5 Tandem和普通的Cy5染料相比，有什么優(yōu)勢？
答：(1)PE-Cy5 Tandem(貨號2610)與FITC、PE在光譜上重疊范圍小，熒光干擾少，因此實驗中常將PE-Cy5 Tandem與FITC、PE搭配使用。普通的Cy5染料與單核細胞和粒細胞的非特異性結(jié)合多，實驗結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性。
(2)PE-Cy5 Tandem具有較高的熒光強度和穩(wěn)定性，可用于標記表達水平較低的蛋白。普通的Cy5染料的熒光強度和穩(wěn)定性較低，適用于標記表達水平較高的蛋白。
(3)二者的染色步驟類似，主要根據(jù)蛋白的表達水平選擇適合自己實驗的產(chǎn)品。
16問：Cy5DIGE NHS酯是什么？它和Cy5NHS酯有什么區(qū)別？
答：Cy5DIGE NHS ester(貨號25306)是一種專門用于差異凝膠電泳(DIGE)分析的染料，它可以與C2DIGE和/或C3DIGE一起使用，來比較兩個或三個樣品中的蛋白質(zhì)表達。Cy5DIGE NHS ester具有遷移匹配和高分辨率的蛋白質(zhì)檢測能力。Cy5NHS則是一種更通用的染料，它可以用于標記核酸分子(DNA和RNA)以及其他生物分子。
