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當(dāng)前位置：西安百螢生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>百螢課堂之DNA定量試劑盒的實(shí)驗(yàn)方案
高靈敏度熒光的DNA定量試劑盒針對(duì)CytoCite和Qubit熒光分析儀進(jìn)行了優(yōu)化。DNA定量是用于各種基因組分析的DNA樣品制備中非常重要的。 這種Portelite dsDNA定量試劑盒提供了一種使用手持式熒光分析儀使用Helixyte Green探針定量dsDNA的快速方法。 它針對(duì)Cytocite 和Qubit 熒光計(jì)進(jìn)行了優(yōu)化。 Portelite dsDNA定量分析線性超過(guò)五個(gè)數(shù)量級(jí)。 該測(cè)定法對(duì)RNA上的雙鏈DNA（dsDNA）具有高度選擇性，并且設(shè)計(jì)為對(duì)于25pg / uL至100ng / uL的初始樣品濃度是準(zhǔn)確的。 Helixyte Green在與dsDNA結(jié)合后表現(xiàn)出大的熒光增強(qiáng)，并且比UV吸光度讀數(shù)更敏感。
一．百螢DNA定量試劑盒適用儀器
量子位熒光計(jì)
Ex: 480nm
Em: 520nm
規(guī)格:0.2mL PCR小瓶
CytoCite熒光計(jì)
Ex: 480nm
Em: 520nm
規(guī)格:0.2mL PCR小瓶
二．百螢DNA定量試劑盒實(shí)驗(yàn)方案
溶液制備
Helixyte Green 工作溶液制備：
為10個(gè)樣品制備足夠的工作溶液，將10μL Helixyte Green （組分A）加入2 mL DNA分析緩沖液（組分B）中。 注意：用鋁箔覆蓋或?qū)⑵渲糜诤诎抵?，以保護(hù)工作溶液免受光照。 注意：我們建議將此溶液用塑料容器而不是玻璃制備，因?yàn)槿玖峡赡軙?huì)吸附到玻璃表面。 為獲得佳效果，該溶液應(yīng)在其制備后幾小時(shí)內(nèi)使用。
樣品實(shí)驗(yàn)方案
樣品體積是1~20μL（取決于DNA樣品的估計(jì)濃度）。推薦樣品體積為10μL，DNA濃度范圍為0.5~10 ng /μL。如果使用其他樣品量，請(qǐng)?jiān)跐舛扔?jì)算中調(diào)整稀釋倍數(shù)。
1.基于10μL樣品體積生成以下方案，DNA濃度在0.5~10 ng /μL范圍內(nèi)。
1.1在每個(gè)Cytocite 樣品管（＃CCT100）或等效的0.2 mL PCR管中加入190μL1XHelixyte Green 工作溶液注意：使用薄壁聚丙烯，透明的0.2 mL PCR管，如＃CCT100。
1.2將DNA標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品10μL加入每個(gè)試管中，然后渦旋混合2~3秒。
1.3讓所有試管在室溫下孵育2分鐘。
1.4將樣品插入CytoCite 或Quibit ，并用綠色熒光通道監(jiān)測(cè)熒光。按照適用于CytoCite 熒光分析儀的步驟進(jìn)行操作。
2.標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的制備
對(duì)于Portelite 分析，您可以選擇使用DNA標(biāo)準(zhǔn)制作校準(zhǔn)曲線。 以下是生成定制DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的簡(jiǎn)要方案：
2.1用DNA Assay Buffer進(jìn)行稀釋，得到10,8,6,4,2,1,0.5,0 ng /μLDNA標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。
2.2將190μLHelixyteGreen 工作溶液加入0.2 mL PCR管中。
2.3每管加入10μL標(biāo)準(zhǔn)品或10μL樣品。
2.4在室溫下孵育反應(yīng)2分鐘。
2.5將樣品插入CytoCite 并用綠色熒光通道檢測(cè)熒光。
數(shù)據(jù)分析
從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對(duì)照。 從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值，以獲得基線校正值。 然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程。 該等式可用于計(jì)算濃度樣本。
圖1.使用Portelite 熒光DNA高靈敏度定量試劑盒生成的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。 使用FITC通道定量熒光強(qiáng)度，使用log-log best-fit計(jì)算回歸模型。 檢測(cè)限為10 pg /μL。
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