熒光鈣Ca2+指示劑（例如Indo-1,Fura-2,Fluo-3和Fluo-4）通常用于監(jiān)測(cè)包括HTS、熒光成像和流式細(xì)胞術(shù)在內(nèi)的各種應(yīng)用中的Ca2+應(yīng)答。然而，這些染料需要有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑（例如丙H舒）的存在，以防止許多細(xì)胞類型（例如CHO和Hela）的指示劑泄露。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)細(xì)胞有毒性，其中一些已知是某些GPCR（例如趨化因子受體）的抑制劑。由于這些原因，這些染料的用途是有限的。因此，我們開(kāi)發(fā)了一種超亮無(wú)丙H舒熒光鈣指示劑------Calbryte^TM520AM.Calbryte^TM520AM具有細(xì)胞滲透性和非熒光性。一旦進(jìn)入細(xì)胞，Calbryte^TM520AM通過(guò)脂酶被加工成Calbryte^TM520。當(dāng)與Ca2+結(jié)合時(shí)，Calbryte^TM520產(chǎn)生非常明亮的熒光信號(hào)，具有非常高的信號(hào)與背景（S/B比率）。

Calbryte^TM520AM熒光鈣指示劑原理

方法：

1. 將100µL/孔細(xì)胞接種于37℃培養(yǎng)箱中的96孔黑壁/透明底Costar板中過(guò)夜；

2. 將細(xì)胞與含有鈣指示劑(5µg/mL)的100µL染料上樣緩沖液在37℃溫育30分鐘至1小時(shí)；

3. 然后在有或沒(méi)有感興趣的化合物的情況下在 37°C 下再孵育 15 分鐘；

4. 去除染料上樣緩沖液并用200µLHHBS（洗滌條件）或留在孔中（無(wú)洗滌條件）；

5. 加入50µL/孔的鈣通量刺激劑，并通過(guò)熒光顯微鏡 (Keyence)、FlexStation (Molecular Devices) 或流式細(xì)胞儀 (NovCell 3000) 監(jiān)測(cè)鈣通量。

結(jié)果：

1.使用丙H舒誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞鈣通量的研究

ATP誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞內(nèi)源性P2Y應(yīng)答。將含有2.5mM丙H舒的PluronicF127緩沖液中的Calbryte^TM520AM或Fluo-4AM與細(xì)胞在37℃溫育45分鐘。10µMATP（終結(jié)果）圖像由熒光顯微鏡使用FITC頻道拍攝。

2. 不使用丙H舒誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞鈣通量的研究

ATP誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞內(nèi)源性P2Y應(yīng)答。將含有2.5mM丙H舒的PluronicF127緩沖液中的Calbryte^TM520AM或Fluo-4AM與細(xì)胞在37℃溫育45分鐘。10µMATP（終結(jié)果）圖像由熒光顯微鏡使用FITC頻道拍攝。

3.RANTE誘導(dǎo)CHO-CCR5細(xì)胞鈣通量的研究

將表達(dá)趨化因子受體5(CCR5)的CHO細(xì)胞與Calbryte^TM520AM或Fluo-4AM在不同的染料上樣緩沖液中在37℃下孵育1小時(shí)，

A) HHBS，含有含有 Pluronic F127，不含丙H舒。

B) HHBS 與 Pluronic F127 和 2.5 mM 丙H舒。

C) HHBS，含有 Pluronic F127 Plus 緩沖液，不含丙H舒。通過(guò) FlexStation 添加 100 nM RANTES（最終濃度）之前和之后監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi) Ca2+100秒。

4.阿T品抑制CHO-M1細(xì)胞中的鈣通量

將表達(dá) M1 毒蕈堿受體的 CHO 細(xì)胞與 Calbryte™ 520 AM 或 Fluo-4 AM 在不同的上樣緩沖液中在 37°C 下孵育 1 小時(shí)。A) HHBS，含有 Pluronic F127，不含丙H舒。B) HHBS 與 Pluronic F127 和 2.5 mM 丙H舒。C) HHBS，含有 Pluronic F127 Plus 緩沖液，不含丙H舒。將阿T品添加到細(xì)胞中并在 37°C 下再孵育 15 分鐘。通過(guò) FlexStation 添加 1 µM 卡巴D堿（濃度）之前和之后監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 100秒。

5.刀豆蛋白A誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞CCE的研究

每孔懸浮 250K Jurkat 細(xì)胞于無(wú)鈣 HHBS 緩沖液中，然后細(xì)胞在 37°C 下用 含有HHBS 和 Pluronic F127 Plus 的 Calbryte™ 520 AM 或 Fluo-4 AM 孵育 1 小時(shí)。再使用含或不含通道抑制劑辣椒素的 刀豆蛋白 A（最終濃度3 µg/ml）與細(xì)胞在 37°C 下孵育 10 分鐘。通過(guò) FlexStation 在加入 5 mM CaCl2 前后監(jiān)測(cè)電容性鈣離子（Ca2+）的輸入（CCE），持續(xù) 100 秒。

6.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ATP誘導(dǎo)的鈣通量

A

B

將 CHO-K1 細(xì)胞與 Calbryte™ 520 AM 或 Fluo-4 AM 一起在含有 Pluronic F127 和 2.5 mM 丙H舒的 HHBS 中于 37°C 孵育 30 分鐘。將細(xì)胞從孔中分離并用HHBS洗滌兩次。在添加 ATP 之前和添加 ATP 之后隨時(shí)間推移通過(guò)流式細(xì)胞儀獲取基線。A)向細(xì)胞中添加 0 µM、1 µM 或 10 µM ATP。圖表上的箭頭表示添加 ATP 和實(shí)際分析之間的時(shí)間。B)熒光信號(hào)隨時(shí)間的變化。時(shí)間0是ATP刺激時(shí)間，初始檢測(cè)相對(duì)于刺激大約30秒。

結(jié)論：

1. Calbryte™ 520 AM 使用熒光顯微鏡、FlexStation 和流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)CHO-K1、CHO-M1、CHO-CCR5 和 Jurkat 細(xì)胞中的Ca2+通量,比Fluo-4 AM 產(chǎn)生更明亮的信號(hào)（增加 3-4 倍）和更高的 S/B 比率（增加 3-4 倍）；

2. 如果沒(méi)有丙H舒，Fluo-4 AM 無(wú)法檢測(cè) CHO 細(xì)胞中的 Ca 2+通量，但是 Calbryte™ 520 AM 仍能獲得良好的細(xì)胞滯留率和 S/B 比值。

3. 在 Calbryte™ 520 AM 和 Fluo-4 AM 培養(yǎng)的細(xì)胞中， Ca2+通量刺激劑或抑制劑的EC50計(jì)算值相當(dāng)。