用于定義細(xì)胞活力的參數(shù)，例如細(xì)胞膜完整性、線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)脂酶活性，可以共同用于區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞群，確定細(xì)胞活力，并篩選化合物的細(xì)胞毒性。這些參數(shù)構(gòu)成了一些策略的基礎(chǔ)，例如我們的Live or Dead細(xì)胞活性檢測試劑盒，該試劑盒結(jié)合了兩種熒光探針：活細(xì)胞脂酶底物和細(xì)胞不可滲透的DNA結(jié)合染料，以在樣品中實(shí)現(xiàn)兩種顏色的活細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分。Live or Dead 檢測可用于通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或熒光測定法檢查真核細(xì)胞和細(xì)菌。

Live or Dead細(xì)胞活性測定原理

AAT Bioquest的 Live or Dead細(xì)胞活性檢測試劑盒是基于使用兩種熒光探針同時(shí)測定活細(xì)胞和死細(xì)胞。活細(xì)胞的標(biāo)記使用酮酸酯（Acetoxymethyl，AM）衍生物的草銨綠（calcein）或線粒體膜電位探針，而死細(xì)胞的標(biāo)記使用細(xì)胞不可滲透的DNA結(jié)合染料。酮酸酯衍生物是非熒光脂酶底物，很容易擴(kuò)散穿過完整的細(xì)胞膜并滲透到活細(xì)胞中。一旦進(jìn)入細(xì)胞，非特異性細(xì)胞內(nèi)脂酶將底物水解為熒光產(chǎn)物，將其固定在細(xì)胞內(nèi)。底物發(fā)出的熒光信號是活細(xì)胞具有脂酶活性和完整膜的指示器。另外，線粒體膜電位探針也可用于區(qū)分活細(xì)胞。這些可滲透膜的陽離子染料被 passively 沿著細(xì)胞膜擴(kuò)散，并在健康細(xì)胞的線粒體內(nèi)積累，產(chǎn)生顯著的熒光信號。相反，失去線粒體膜電位的死細(xì)胞將排除該染料，并且不會觀察到信號。這種細(xì)胞不可滲透的DNA結(jié)合染料選擇性的與DNA結(jié)合，具有高親和力，只能穿透死細(xì)胞受損的膜，并在與核酸結(jié)合后會發(fā)出明顯的熒光。然而，具有完整細(xì)胞膜的健康活細(xì)胞將阻止該染料進(jìn)入細(xì)胞，從而產(chǎn)生負(fù)信號。由于細(xì)胞活性的測定取決于這些物理特性，不影響這些參數(shù)的細(xì)胞毒性事件可能無法準(zhǔn)確地使用這些方法評估。

Live or Dead真核細(xì)胞檢測

Live or Dead細(xì)胞活性檢測試劑盒“紅/綠雙色熒光"

Live or Dead細(xì)胞活性檢測試劑盒“紅/綠雙熒光"是一種快速簡便的試劑盒，用于準(zhǔn)確測定真核細(xì)胞中的細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性。該試劑盒包含兩種探針：CytoCalcein Green和碘化丙錠，可以同時(shí)添加到樣品中，通過雙熒光區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，而無需任何洗滌步驟。CytoCalcein Green是一種熒光脂酶底物，可以用綠色熒光標(biāo)記具有脂酶活性的活細(xì)胞，同時(shí)，碘化丙錠是一種不可滲透細(xì)胞膜的核酸染料，可以用紅色熒光標(biāo)記死細(xì)胞。該試劑盒可以輕易適用于各種熒光平臺的高通量測定，包括熒光酶標(biāo)儀，成像系統(tǒng)和流式細(xì)胞儀，并且與3D細(xì)胞培養(yǎng)模型、球體、貼壁細(xì)胞、非貼壁細(xì)胞和某些組織兼容。與其他評估細(xì)胞活力的替代方法（如臺盼藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)或鉻釋放實(shí)驗(yàn)）相比，相比，Live or Dea 細(xì)胞活性檢測試劑盒在定義細(xì)胞毒性事件方面更安全、更經(jīng)濟(jì)、更敏感。

圖1.活細(xì)胞或死細(xì)胞活性的影像學(xué)檢測。用Live或Dead細(xì)胞活性檢測試劑盒分析90%活細(xì)胞，0%固定細(xì)胞和兩個(gè)細(xì)胞的混合物（活/固定=50/50），并用熒光顯微鏡在FITC和TRITC通道中成像。

Live or Dead細(xì)胞活性檢測試劑盒“紅/綠雙色熒光"優(yōu)點(diǎn)：

1. 對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定且有選擇性的雙熒光染色；

2. 該試劑盒采用快速簡單的一步染色程序，可以同時(shí)添加兩種探針；

3. 無需洗滌使其非常適合高通量篩選應(yīng)用；

4. 該試劑盒可通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和熒光酶標(biāo)儀檢測；

5. 適用于貼壁和非貼壁細(xì)胞。

Live or Dead細(xì)胞活性檢測試劑盒“紅/藍(lán)雙色熒光"

Live or Dead細(xì)胞活性檢測試劑盒“紅/藍(lán)雙色熒光"是一種方便的試劑盒，基于細(xì)胞膜完整性和線粒體膜電位活性來確定細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性。該試劑盒具有兩種探針Cellbrite^TM Red和Nuclear Blue^TM DCS1,可以同時(shí)添加到樣品中，用于活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙色熒光測定。ellbrite^TM Red能夠?qū)⒕哂谢钴S線粒體的活細(xì)胞染成紅色，而不可滲透膜的DNA染料Nuclear Blue^TM DCS1將死細(xì)胞染成藍(lán)色。該試劑盒可以輕松適用于多種熒光平臺的高通量分析，如熒光酶標(biāo)儀分析，免疫細(xì)胞化學(xué)，成像與流式細(xì)胞術(shù)，并且與3D細(xì)胞培養(yǎng)模型、球體、貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞兼容。

圖2.Live or Dead 細(xì)胞活力檢測試劑盒（雙熒光）（Cat#22788）標(biāo)記的HeLa細(xì)胞的熒光圖像。HeLa細(xì)胞以每孔100,000個(gè)細(xì)胞/100 µL的密度在96孔黑壁/透明底板上過夜培養(yǎng)。細(xì)胞在37°C下用0-1 µM的staurosporine（SS）處理4小時(shí)（A-D），或者用乙醇固定（E），然后與染料加載溶液孵育1小時(shí)。分別使用Texas Red或Cy5濾光片測量活細(xì)胞（紅色）和死亡細(xì)胞（藍(lán)色）的熒光信號。相應(yīng)的熒光信號使用FlexStation®熒光酶標(biāo)儀（Molecular Devices）在底部讀取模式下進(jìn)行測量，波長分別為Ex/Em = 610/650（Cutoff=630 nm，紅色）和Ex/Em = 360/450（cutoff=420 nm，藍(lán)色）。

表1.真核細(xì)胞Live or Dead 細(xì)胞活性測定選擇指南

1. FC=流式細(xì)胞術(shù) FM=熒光顯微鏡 MA=微孔板測定

Live or Dead細(xì)菌檢測

MycoLight熒光活/死細(xì)菌成像試劑盒

MycoLight熒光活/死細(xì)菌成像試劑盒提供了一種快速簡便的方法來區(qū)分懸浮或固定在濾膜上的活細(xì)菌或死細(xì)菌。該試劑盒包含兩種探針：MycoLight520和碘化丙錠，可以同時(shí)添加到細(xì)菌樣品中，無需任何洗滌步驟，非常適合高通量篩選。MycoLight520是一種能穿透細(xì)菌質(zhì)膜的熒光酯酶底物，能夠通過被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌的質(zhì)膜，并將活細(xì)菌染成綠色。相反，碘化丙錠只能滲透受損的細(xì)菌膜，將死細(xì)菌標(biāo)記為紅色熒光。因此，通過適當(dāng)混合MycoLight™ 520和碘化丙錠染料，具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)菌發(fā)出綠色熒光，并使用標(biāo)準(zhǔn)熒光素濾光片進(jìn)行分析，而受損細(xì)胞膜的死細(xì)菌發(fā)出紅色熒光，并使用標(biāo)準(zhǔn)TRITC濾光片進(jìn)行分析。

圖3.用MycoLight 熒光活/死細(xì)菌成像試劑盒染色活的和死的枯草芽孢桿菌的混合群體。 具有活性細(xì)胞內(nèi)酯酶的活細(xì)菌顯示綠色熒光，而70%酒精殺死的細(xì)胞膜受損的死細(xì)胞則顯示紅色熒光。

表二.MycoLight熒光活/死細(xì)菌成像試劑盒

Live or Dead流式細(xì)胞術(shù)固定分析

能夠區(qū)分和排除死細(xì)胞的能力，實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞群體的清晰分離和鑒定，這大大提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，消除了各種試劑與死細(xì)胞的非特異性結(jié)合所引起的不良偽影和假陽性。為了從流式細(xì)胞儀讀數(shù)中區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞群體，AAT Bioquest提供了多種Live or Dead可固定性死細(xì)胞染色試劑盒。標(biāo)記穩(wěn)定、高效，并且與固定劑和滲透緩沖液兼容，從而可以進(jìn)一步分析細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。

Live or Dead固定化死細(xì)胞標(biāo)記試劑盒

使用無法穿透細(xì)胞膜的胺基反應(yīng)性染料，在流式細(xì)胞儀中區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。每個(gè)試劑盒提供的染料可以輕松滲透受損的死細(xì)胞膜，并共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)外的含有胺基的蛋白質(zhì)上，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號。而在活細(xì)胞上，熒光信號微弱，因?yàn)榧?xì)胞表面的胺基僅可與染料反應(yīng)。活細(xì)胞和死細(xì)胞群體之間信號強(qiáng)度的差異明顯，因此很容易將死細(xì)胞排除在分析之外。使用Live or Dead固定化死細(xì)胞標(biāo)記試劑盒的標(biāo)記的細(xì)胞可以被固定、滲透化處理，并用于細(xì)胞內(nèi)免疫表型分析或其他多參數(shù)染色實(shí)驗(yàn)。AAT Bioquest提供多種Live or Dead固定化死細(xì)胞標(biāo)記試劑盒，設(shè)計(jì)用于有效激發(fā)主要的激發(fā)源，包括350、405、488、532、561、633和647 nm激光線，并在常見通道發(fā)射。這些試劑盒是保存特定細(xì)胞的熒光圖像的優(yōu)秀工具，也可用于熒光顯微鏡演示。

表三.用于流式細(xì)胞術(shù)的Live or Dead固定化死細(xì)胞標(biāo)記試劑盒