熒光顯微鏡是監(jiān)測細(xì)胞生理狀態(tài)的重要工具。熒光顯微鏡最關(guān)鍵的特性是能夠在黑暗背景下照亮熒光物體，這些物體可能非常微弱，若無此技術(shù)則難以檢測。為了優(yōu)化熒光，必須盡可能Z大化圖像的亮度和分辨率。為了區(qū)分目標(biāo)熒光和視野中的其他物體，使用濾光片組合來觀察特定的激發(fā)光達(dá)到樣品中的熒光團(tuán)。

對熒光顯微鏡的理解,重要的是要了解熒光本身的基礎(chǔ)過程。熒光涉及熒光指示劑吸收光能(即光子)的過程,隨后在僅僅幾納秒內(nèi)發(fā)射部分光能(作為另一個光子)。在這個過程中,會損失一部分能量,所以發(fā)射的光子擁有比吸收光子更低的能量。熒光指示劑發(fā)射的光通常會具有比激發(fā)光更長的波長。熒光顯微鏡原理上是通過將發(fā)射光與激發(fā)光分離開來,從而將樣本中的暗部和亮部分離出來。

圖1.顯微鏡的基本組成部分和熒光成像的光路。不同于單一的光路，有兩個或多個濾光鏡與激發(fā)光和發(fā)射光波長相關(guān),位于目標(biāo)鏡前后。圖像由BioRender制作。

影響熒光顯微鏡的三個常見因素:亮度、分辨率和維護(hù)

亮度

圖像的總亮度將影響熒光是否容易被檢測和拍攝。樣品必須提供足夠的光能量來激發(fā)每個附著在樣品上的染色體所需要的波長。適當(dāng)濾光器的選擇將有助于最大限度地將發(fā)射的熒光導(dǎo)向觀察或相機(jī)管,同時阻止不需要的波長。因此,汞燈或氙燈是理想的燈源,因?yàn)樗鼈兡芰扛?/span>,將提供大量 Needed熒光激發(fā)能量來適當(dāng)照亮樣品。

此外，物鏡有助于從樣本中收集光線，并直接影響觀察到的圖像的亮度強(qiáng)度。建議使用具有高質(zhì)量色差校正的物鏡，以幫助產(chǎn)生更清晰的圖像。物鏡還應(yīng)設(shè)計(jì)成在接近紫外線波長的光照射下不會自發(fā)熒光。油浸物鏡可以用來幫助減少由于光線在玻璃載玻片和/或蓋玻片表面反射而導(dǎo)致的光損失。盡管熒光顯微鏡制造商試圖制造全部包含自發(fā)熒光組件的顯微鏡，但這仍然應(yīng)該被考慮在內(nèi)。

分辨率

合適的蓋玻片也有助于提高圖像分辨率。蓋玻片的厚度不等，通常在0.01至0.03毫米之間，顯微鏡物鏡應(yīng)該進(jìn)行微調(diào)以適應(yīng)這些變化。有時，購買精度非常高的蓋玻片是確保物鏡校正始終以最佳狀態(tài)進(jìn)行的最佳途徑。

物鏡應(yīng)該定期使用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行清潔，大約每個月一次。任何多余的油都有可能吸附灰塵，這將降低生成圖像的質(zhì)量和分辨率。在為油浸物鏡選擇油時，確保油不含PCB，幾乎不自發(fā)熒光，且在物鏡與蓋玻片接口使用時不會形成氣泡。

維護(hù)

操作顯微鏡的人應(yīng)該秉持以下原則:

1.保持所有光學(xué)元件全部無塵,清潔,防止油脂,溶劑或任何其他可能的污染物。

2.顯微鏡應(yīng)存放在煙霧盡量少、環(huán)境盡可能清潔、振動少或?yàn)榱恪⑼L(fēng)系統(tǒng)空氣流動平穩(wěn)的房間內(nèi)。

3.當(dāng)不使用時應(yīng)給顯微鏡蓋上罩子,所有附屬組件盡可能保存在防塵密閉容器內(nèi)存儲。

注意：標(biāo)準(zhǔn)各不相同，但通常最佳做法是盡量減少接觸。最重要的是細(xì)致對待,以很大程度地避免損壞,校準(zhǔn)問題及其他可避免的問題。

4.不應(yīng)使用腐蝕性溶劑清潔儀器的任何部分，稀釋的肥皂水通常是好的清潔劑。在清潔物鏡前，應(yīng)先使用壓縮氣體除去松散的灰塵和顆粒。內(nèi)部鏡片上的污垢應(yīng)由專業(yè)人員清除，因此聯(lián)系制造商將了解下一步的操作。對于外部鏡片和其他容易接觸的組件，溫和而持續(xù)的清潔和維護(hù)可以延長熒光顯微鏡的使用壽命。

5.清潔鏡頭時一定要非常輕柔,因?yàn)榧词故晴R頭紙也可能在鏡面的表面產(chǎn)生極細(xì)的劃痕。鏡頭清潔布是常見的選擇。有許多專門用于光學(xué)表面清洗的溶劑,但必要時也可以用乙醇替代。蒸餾水也常被選用。值得注意的是,其他溶劑可能會與鏡片上產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)的涂層。例如,氨常被證明會破壞防反射涂層。丙酮也可能對塑料部件產(chǎn)生損害,所以清洗時需要小心。

注意:清潔鏡片時,首先用清潔劑或乙醇浸濕棉簽,輕輕擦拭鏡片表面幾遍,每擦一次都要轉(zhuǎn)動棉簽,以防粉塵再次沾染上表面。

圖2.清洗外部顯微鏡鏡片去除污跡的有效方法。好的做法是由中心向外進(jìn)行輕輕圓周型律動,而不是隨機(jī)或不穩(wěn)定的移動,否則可能會漏洗部分區(qū)域或者造成損壞。圖示由BioRender制作。

熒光顯微鏡故障處理技巧

應(yīng)盡可能防止光漂白，因?yàn)檫@會對樣本造成損害?？梢酝ㄟ^向樣本添加抗褪色試劑、使用特殊介質(zhì)，減少樣本暴露于光下的時間來實(shí)現(xiàn)。減少這種曝光包括減少總體光強(qiáng)度或在不觀察或拍攝樣本時，使用顯微鏡照明器中的濾光片滑塊或快門阻擋激發(fā)光的方法。

如果在制片前清洗染色后的樣本以去除過多的熒光物質(zhì)，也可以限制樣本的自發(fā)熒光。

雖然透明膠片可能因其能提供增強(qiáng)的對比度和色彩飽和度而更受青睞，但日光平衡透明膠片可能有助于提供樣本顏色、分辨率或?qū)Ρ榷鹊淖罴殉尸F(xiàn)。

建議和預(yù)防措施

 表一.不斷增加的媒體注意事項(xiàng)

1.理想情況下所有顯微鏡觀察都應(yīng)在黑暗房間內(nèi)進(jìn)行,對熒光顯微鏡來說這一點(diǎn)尤其重要。因?yàn)槿搜酆茈y快速適應(yīng)黑暗,而熒光信號比較弱時,眼睛就很難在黑暗中辨別細(xì)微的熒光變化。

2當(dāng)選擇適合顯微鏡的組件時,建議選擇一款配有玻璃或石英透鏡的目標(biāo)物鏡。這種鏡頭材料在近紫外光區(qū)域具高透明度。

3.使用低放大倍數(shù)的投影鏡將有助于限制圖像的總放大倍數(shù)。

4.對比反射式熒光光學(xué)成像,總體來說采用透射式熒光時成像效果較差。不過,如果采用透射式,使用暗場造片機(jī)可以有助于改善成像質(zhì)量。

注意:選擇合適的光圈濾膜也有助于優(yōu)化樣品中熒光素的對比度。關(guān)鍵是這些濾膜需要匹配樣品的熒光激發(fā)和二級熒光特性。

最佳的光源選擇是氙氣燈和汞蒸氣燈，或者可以精確調(diào)節(jié)到特定波長的激光燈。

對任何類型的熒光顯微鏡來說,在照明源和熒光濾鏡之間加入一個隔熱濾鏡都非常重要。這能有效限制可能造成的過熱損害。

當(dāng)燈具開始閃爍,或者樣品的部分區(qū)域明暗不均時,很可能就是時候更換光源了。

圖3.U2OS細(xì)胞經(jīng)過1小時的Calcein AM孵育后固定于含2%甲醛的96孔黑色板內(nèi)。去除全部培養(yǎng)基后加入防褪色染料。使用熒光顯微鏡與相同的曝光設(shè)置對0秒和30秒的FITC信號強(qiáng)度進(jìn)行比較。