01「百螢v-iFluor 700標(biāo)記簡介」
膜聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族。它們富含真核生物，屬于參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的普遍存在的細胞質(zhì)蛋白家族。 膜聯(lián)蛋白V的優(yōu)先結(jié)合配偶體是磷脂酰絲an酸(PS)，其通常保持在細胞膜的內(nèi)葉(細胞質(zhì)側(cè))。在細胞凋亡中，PS被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。磷脂酰絲an酸在細胞表面上的出現(xiàn)是細胞凋亡的初始/中間階段的通用指示，并且可以在觀察到形態(tài)變化之前檢測到。我們的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物是一組監(jiān)測細胞功能的工具，旨在通過測量磷脂酰絲an酸的易位來監(jiān)測細胞凋亡。
膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物在Ca2+存在下與凋亡細胞表面上的PS結(jié)合，它也可以通過壞死細胞膜或死細胞并與細胞內(nèi)部的PS結(jié)合。因此，我們建議將細胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物結(jié)合使用，以區(qū)分死細胞和凋亡細胞。
02「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記適用儀器」
流式細胞儀、熒光顯微鏡
03「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記實驗方案」
概述
用測試化合物(200μL/樣品)制備細胞
添加Annexin V結(jié)合物測定溶液
室溫孵育30-60分鐘
用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析
1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞：
1.1制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。
1.2用測試化合物處理細胞一段所需的時間(用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時)以誘導(dǎo)細胞凋亡。
1.3離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。
1.4將細胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液中(來自步驟1.1)。
1.5在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。
可選：在細胞內(nèi)加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。
1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。
1.7在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)以增加體積(參見下面的步驟1.8)。
1.8使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度(參見下面的步驟2或3)。
2.使用流式細胞儀分析：
通過使用具有適當(dāng)過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。
注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。
3.使用熒光顯微鏡分析：
3.1移取步驟1.6的細胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)重懸細胞。將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。
注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育(步驟1.6)后，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細胞也可以在2%甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。
3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞
04「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記數(shù)據(jù)分析」
下圖是使用流式細胞儀檢測膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲an酸在Jurkat細胞凋亡中的結(jié)合活性的實例。在活的非凋亡細胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450檢測非誘導(dǎo)細胞中的先天性細胞凋亡，其通常為所有細胞的2-6%。在凋亡細胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲an酸結(jié)合，磷脂酰絲an酸位于細胞膜的外部小葉上，導(dǎo)致染色強度增加。
圖1.在Jurkat細胞中檢測膜聯(lián)蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰絲an酸的結(jié)合活性。將Jurkat細胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中不用(藍色)或用1μM星形孢菌素(紅色)處理5小時，然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分鐘。使用FACSCalibur(Becton Dickinson，San Jose，CA)流式細胞儀，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下測量膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450的熒光強度。
