Amplite 熒光法草酰乙酸檢測(cè)試劑盒 紅色熒光是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)草酰乙酸的試劑盒，草酰乙酸是檸檬酸循環(huán)的重要組成部分，它與乙酰*酶A反應(yīng)生成檸檬酸鹽。它還涉及糖異生，尿素循環(huán)，乙醛酸循環(huán)，氨基酸合成和脂肪酸合成。草酰乙酸的缺乏限制了糖原異生和尿素循環(huán)功能，并且可以導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少。草酰乙酸也可用作血液谷*酸劑，在創(chuàng)傷性腦損傷后提供神經(jīng)保護(hù)，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元損失減少和神經(jīng)功能。Amplite™熒光草酰乙酸檢測(cè)試劑盒為生物樣品中的草酰乙酸定量提供了靈敏的檢測(cè)方法。草酰乙酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，通過酶偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫。通過熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 540 / 590nm下用Amplite™Red監(jiān)測(cè)過氧化氫的產(chǎn)生。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 熒光法草酰乙酸檢測(cè)試劑盒。

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備測(cè)試樣品（50μL）和連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（50μL）

加入等體積的測(cè)定混合物（50μL）

在室溫下孵育

監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度在Ex / Em = 540/590 nm

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分。

操作方法

1.準(zhǔn)備連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品：

1.1將100μLDdH2O加入草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（組分E）中，制成100mM草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2制備草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液：將10μL100mM草酰乙酸鹽（來(lái)自步驟1.1）加入990μL測(cè)定緩沖液（組分C）中，得到1mM草酰乙酸溶液。 將100μL的1mM草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入900μL測(cè)定緩沖液中以制備100μM草酰乙酸溶液。進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到約30,10,3,1,0.3和0.1μM連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3根據(jù)說(shuō)明書中的表1，將50μL含草酰乙酸的樣品和連續(xù)稀釋的草酰乙酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品加入到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

2.準(zhǔn)備草酰乙酸測(cè)定混合物：

2.1制作Amplite 紅色底物原液（200X）：將50μLDMSO（組分F）加入Amplite Red底物（組分A）中，制成200X Amplite Red底物原液。

2.2制備草酰乙酸脫羧酶（OAC）儲(chǔ)備溶液（100X）：將50μLddH 2 O加入草酰乙酸脫羧酶（組分D）中以制備100μL草酰乙酸脫羧酶原液。

2.3制備測(cè)定混合物：將5mL測(cè)定緩沖液（組分C）加入一個(gè)酶混合瓶（組分B）中充分混合。 將50μLOAC儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟2.2）和25μL200X Amplite Red儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟2.1）轉(zhuǎn)移到瓶中并充分混合。

注意1：分析混合物不穩(wěn)定，及時(shí)使用，避免直接暴露在光線下。

注意2：將未使用的200X Amplite Red原液儲(chǔ)存在-20℃，避免光照和反復(fù)凍融循環(huán)。

3.運(yùn)行草酰乙酸測(cè)定：

3.1將50μL測(cè)定混合物（來(lái)自步驟2.3）添加到草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見步驟1.3），以使總草酰乙酸測(cè)定體積為100μL/孔。

注1：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品，25μLAssay混合液。

注2：在pH 6.5至7.0下進(jìn)行草酰乙酸測(cè)定。

3.2在室溫下孵育反應(yīng)混合物30分鐘至1小時(shí)。

3.3使用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 540 / 590nm（截止：570nm）監(jiān)測(cè)熒光增加。