Amplite NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒）增強(qiáng)靈敏度是美國(guó)AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)總NAD和NADH的試劑盒，煙X胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙X胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過(guò)酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定基于監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定的短紫外波長(zhǎng)使得傳統(tǒng)方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite 比色總NAD / NADH檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)總NAD和NADH提供了一種便捷的方法。系統(tǒng)中的酶特異性識(shí)別酶循環(huán)反應(yīng)中的NAD / NADH。無(wú)需從樣品混合物中純化NAD / NADH。酶循環(huán)反應(yīng)顯著提高了檢測(cè)靈敏度。 NADH探針是一種生色傳感器，在NADH減少時(shí)具有460nm的吸光度。 NADH探針的吸收與溶液中NADH的濃度成正比。 Amplite™比色法總NAD和NADH分析試劑盒提供靈敏的分析，可在100μL分析體積中檢測(cè)低至0.1μM的總NAD / NADH。與試劑盒＃15258相比，該試劑盒具有更高的靈敏度。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板檢測(cè)示例

概述

準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物（50μL）

加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）

在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)

監(jiān)測(cè)460 nm處的吸光度

注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)。

操作步驟

1.準(zhǔn)備NADH儲(chǔ)備溶液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADH儲(chǔ)備溶液。

注意：未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20 ℃。

2.準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物：

2.1將8 mL NADH探針緩沖液（組分B-II）加入到NAD / NADH回收酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

2.2將2 mL NADH探針（組分B-I）加入上述瓶中（來(lái)自步驟2.1）并充分混合。

注意：這種NAD / NADH反應(yīng)混合物足以進(jìn)行200次分析。未使用的NAD / NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

3.準(zhǔn)備NADH標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液（0至10μM）：

3.1將10μL1mMNADH儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟1）加入990L PBS緩沖液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL10M NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液（來(lái)自步驟3.1）進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3如表1和2中所述，將含有NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含NAD / NADH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NADH測(cè)定：

4.1將50μLNAD/ NADH反應(yīng)混合物（來(lái)自步驟2.2）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見(jiàn)步驟3.3），使總NAD / NADH測(cè)定體積為100μL/孔

注意1：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應(yīng)混合物。

注意2：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見(jiàn)，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。

4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測(cè)吸光度的增加。