Amplite 比色法鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒 藍(lán)色熒光是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)鞘磷脂的試劑盒，鞘磷脂酶（SMase）是一種酶，負(fù)責(zé)將鞘磷脂（SM）切割成磷酸*堿和神經(jīng)酰胺。細(xì)胞中SMase的在細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用。已經(jīng)基于它們的陽(yáng)離子依賴性和佳作用pH鑒定了五種類型的鞘磷脂酶（SMase）。它們是溶酶體酸性SMase，分泌鋅依賴性酸性SMase，鎂依賴性中性SMase，鎂依賴性中性SMase和堿性SMase。在這五種類型中，溶酶體酸性SMase和鎂依賴性中性SMase被認(rèn)為是細(xì)胞對(duì)應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的主要候選物。

我們的Amplite 比色鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)中性SMase活性或篩選其抑制劑提供了一種靈敏的方法。 該試劑盒使用我們專有的Amplite Blue作為比色探針，間接定量鞘磷脂酶（SMase）水解鞘磷脂（SM）產(chǎn)生的磷酸*堿。它可用于測(cè)量血液，細(xì)胞提取物或其他溶液中的SMase活性。655nm處的光吸收與磷酸*堿的形成成比例，因此與SMase活性成比例。該試劑盒是一種優(yōu)化的“混合和讀數(shù)"分析，與HTS液體處理儀器兼容。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 比色法鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒 。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備鞘磷脂工作溶液（50μL）

添加SMase標(biāo)準(zhǔn)品和/或SMase測(cè)試樣品（50μL）

在37°C孵育1-2小時(shí)

加入鞘磷脂酶工作溶液（50μL）

在室溫下孵育持續(xù)1-2小時(shí)

監(jiān)測(cè)655nm處的吸光度

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分的一個(gè)小瓶（或瓶）。

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液配制

1.1鞘磷脂酰*堿酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10 U/mL）：

將含有0.1%BSA的20µL PBS加入鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品（組分F）瓶中，制成10units/mL鞘磷脂酶的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.2Amplite™ UltraBlue儲(chǔ)備溶液（200X）：

向Amplite™UltraBlue ( C組分)瓶中加入100 μ L DMSO ( G組分)，制成200 × Amplite™UltraBlue儲(chǔ)備液。注：Amplite™Ultra Blue在硫醇(如DTT和2 -巰基乙醇等)存在下不穩(wěn)定。反應(yīng)中DTT或2 -巰基乙醇的終濃度應(yīng)低于10 µ M，Amplite™Ultra Blue在高pH ( > 8.5 )下也不穩(wěn)定。反應(yīng)應(yīng)在p H 7 ~ 8之間進(jìn)行。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將1 µ L的10units/ mL的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入1000 µ L的檢測(cè)緩沖液( E組分)中，生成10 mU / mL的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品。取10 m U / m L鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品500 µ L，進(jìn)行1∶2系列稀釋，得到系列稀釋的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品( SMase7 - SMase1)。注：稀釋后的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.工作溶液配制

3.1.準(zhǔn)備鞘磷脂工作液：

將50μL鞘磷脂（組分B）加入5mL SMase反應(yīng)緩沖液（組分D）中，并充分混合。

注意：應(yīng)及時(shí)使用鞘磷脂工作液。

3.2.鞘磷脂酰*堿酶工作溶液：

在酶混合液(組分A )瓶中加入5 m L Assay Buffer (組分E )，混勻。在酶標(biāo)混合液瓶中加入50 μ L 200X Amplite™Ultra Blue儲(chǔ)備液，開始測(cè)定。注意：應(yīng)及時(shí)使用鞘磷脂酶工作液，注意避光；較長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存容易造成較高的檢測(cè)背景。混合物的渾濁度正常；不會(huì)對(duì)檢測(cè)性能產(chǎn)生干擾。