使用Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯類

1.使用Cal-520®，Cal-590 或Cal-630 AM酯類：

       AM酯是非極性酯，其可以容易地穿過(guò)活細(xì)胞膜，并且通過(guò)活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針加載到活細(xì)胞中。但是，使用AM酯時(shí)必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。它們應(yīng)在使用前重新配制成高質(zhì)量的無(wú)水二甲基亞砜（DMSO）。DMSO儲(chǔ)備溶液可以在-20℃下干燥儲(chǔ)存并避光。在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。以下是我們推薦的將Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活細(xì)胞的方案。該方案僅提供指南，應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)修改。

a）在高質(zhì)量無(wú)水DMSO中制備2至5 mM Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的儲(chǔ)備溶液。

b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM 溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥?chǔ)備溶液解凍至室溫。在Hanks和Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液中使用0.04％Pluronic®F-127制備10至20μM的染料工作溶液。細(xì)胞加載所需指示劑的確切濃度必須憑經(jīng)驗(yàn)確定。

注意：非離子型洗滌劑Pluronic®F-127有時(shí)用于增加Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM 酯的水溶性。

c）如果您的細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，則可將丙*舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（濃度為0.5-1 mM）以減少滲漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來(lái)自步驟b或c）加入細(xì)胞板中。

e）將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60至90分鐘，然后將板在室溫下再孵育30分鐘。

注意：孵育染料超過(guò)2小時(shí)可以為某些細(xì)胞系提供更好的信號(hào)強(qiáng)度。

f）用HHBS（如果適用）替換染料工作溶液，選擇含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑（如1 mM丙*舒）的緩沖液，以去除多余的探針。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（對(duì)于Cal-520 AM），540 / 5000nm（對(duì)于Cal-590 AM）或600 / 640nm（對(duì)于Cal-630 AM ）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。