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間隙連接是由連接蛋白構(gòu)成的專門(mén)的細(xì)胞間膜通道，可選擇性促進(jìn)<1.5 kD的小分子通過(guò)細(xì)胞。它們受電壓，生長(zhǎng)因子，cAMP的緊密調(diào)節(jié)，并且受磷酸化調(diào)節(jié)。Cell Meter™熒光細(xì)胞間隙連接檢測(cè)試劑盒為體外測(cè)定間隙連接功能提供了可靠而強(qiáng)大的檢測(cè)方法。該方法是非侵入性的。對(duì)研究中的細(xì)胞群進(jìn)行劃分，以使其中一小部分載有親脂性細(xì)胞質(zhì)膜可滲透染料Calcein UltraGreen™AM，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)酯酶吸收細(xì)胞時(shí)，該染料會(huì)水解，從而生成Calcein UltraGreen（一種高度熒光且保留良好的膜） -不可滲透的分子。另一部分是DiD，它是一種親脂性膜染料，在摻入膜時(shí)會(huì)橫向擴(kuò)散，使整個(gè)細(xì)胞膜染成深紅色熒光。將兩個(gè)部分混合并在共培養(yǎng)條件下孵育。鈣黃綠素UltraGreen通過(guò)間隙連接轉(zhuǎn)移到DiD染色的細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^(guò)熒光成像或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的Cell Meter™熒光細(xì)胞間隙連接檢測(cè)試劑盒。

適用儀器

流式細(xì)胞儀
激發(fā)：	488 nm and 640 nm激光
發(fā)射：	530/30 nm and 660/20 nm濾波片
通道：	FITC和APC通道

熒光顯微鏡
激發(fā)：	FITC和Cy5濾波片組
發(fā)射：	FITC和Cy5濾波片組
推薦孔板：	黑色透明

實(shí)驗(yàn)方案

樣品分析方案

概述

將鈣黃綠素Ultragreen AM工作溶液添加到細(xì)胞中

將DiD工作溶液添加到細(xì)胞中

在37°C下孵育10-30分鐘

用GAP連接檢測(cè)緩沖液洗滌細(xì)胞

將細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中并按1：1比例混合

使用帶有530/30 nm和660/20 nm發(fā)射濾光片的流式細(xì)胞儀或帶有FITC和Cy5濾光片組的熒光顯微鏡在不同時(shí)間檢測(cè)熒光信號(hào)

儲(chǔ)備溶液配制

1. Calcein Ultragreen AM儲(chǔ)備溶液

將50 µL DMSO（組分D）加入一個(gè)Calcein Ultragreen AM樣品瓶（組分A）中，并充分混合。
注意：將未使用的Calcein Ultragreen AM儲(chǔ)備溶液分裝在-20°C下，一次性使用，以免凍融循環(huán)。
注意：一個(gè)樣品瓶足以進(jìn)行50次測(cè)試。

2. DiD儲(chǔ)備溶液

將100 µL DMSO（組分D）加入DiD（組分B）中并充分混合。
注意：將未使用的DiD儲(chǔ)備溶液分裝在-20°C下，以單次使用，以免凍融循環(huán)。

工作溶液配制

1. Calcein Ultragreen AM工作溶液

將1 µL鈣黃綠素超綠AM儲(chǔ)備溶液添加到1 mL的GAP連接分析緩沖液中并充分混合。
注意：不宜儲(chǔ)存Calcein Ultragreen AM工作溶液，應(yīng)立即使用。
注意：1 mL Calcein Ultragreen AM工作溶液足以進(jìn)行兩次測(cè)試。

2. DiD工作溶液

將1 µL DiD儲(chǔ)備溶液加到1 mL GAP連接分析緩沖液中并充分混合。
注意：DiD工作溶液不宜存儲(chǔ)，應(yīng)立即使用。
注意：1 mL DiD工作溶液足以進(jìn)行兩次測(cè)試。

操作步驟

以下協(xié)議可用作指導(dǎo)，應(yīng)根據(jù)需要進(jìn)行優(yōu)化。

鈣黃綠素超綠AM的細(xì)胞染色

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
除去細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入0.5 mL鈣黃綠素Ultragreen AM工作溶液。
在37°C下孵育細(xì)胞10-20分鐘。
注意：應(yīng)為每個(gè)細(xì)胞系優(yōu)化孵育時(shí)間。
除去染料工作溶液，并用GAP連接分析緩沖液洗滌細(xì)胞。
注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，請(qǐng)使用細(xì)胞橡膠刮板將細(xì)胞從板上分離下來(lái)。
在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。

DiD的細(xì)胞標(biāo)記

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
除去細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入0.5 mL DiD工作溶液。
在37°C下孵育細(xì)胞10-20分鐘。
注意：應(yīng)為每個(gè)細(xì)胞系優(yōu)化孵育時(shí)間。
除去染料工作溶液，并用GAP連接分析緩沖液洗滌細(xì)胞。
注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，請(qǐng)使用細(xì)胞橡膠刮板將細(xì)胞從板上分離下來(lái)。
在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。

GAP連接測(cè)定

將鈣黃綠素染色的細(xì)胞和DiD標(biāo)記的細(xì)胞以1：1的比例混合，并鋪在孔中。
注意：對(duì)于熒光顯微鏡，將每個(gè)50 µL加到96孔板的孔中并混合均勻。
注意：對(duì)于流式細(xì)胞儀，將每一種加入500 µL到6孔板的孔中并混合均勻。
在37°C下孵育細(xì)胞2-3小時(shí)。
使用FITC和Cy5濾光片組通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞。
對(duì)于流式細(xì)胞儀分析：對(duì)于貼壁細(xì)胞，使用細(xì)胞橡膠刮板分離細(xì)胞。一旦細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)或?qū)τ趹腋〖?xì)胞，請(qǐng)用DPBS或您選擇的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。將細(xì)胞重懸于HHBS（#20011）或DPBS或您選擇的緩沖液中，并使用530/30 nm濾光片（FITC通道）和660/20 nm濾光片（APC通道）檢測(cè)。