我們?cè)诮鈨黾?xì)胞時(shí)常常會(huì)遇到問(wèn)題是解凍結(jié)束后，幾乎所有的細(xì)胞都死了。那么問(wèn)題出在那里呢？細(xì)胞解凍時(shí)需要注意哪些問(wèn)題？
其實(shí)細(xì)胞解凍時(shí)細(xì)胞死亡的主要原因有兩個(gè)：一是由于細(xì)胞融化方式有問(wèn)題。二是由于細(xì)胞在高速離心時(shí)被剪切。 

    針對(duì)以上原因，細(xì)胞解凍時(shí)可以嘗試加入溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基，讓它們靜置幾個(gè)小時(shí)到過(guò)夜，然后洗掉含有 DMSO 的培養(yǎng)基，并用普通培養(yǎng)基加血清喂養(yǎng)（增加血清濃度至10% 甚至 20% 一段時(shí)間）。不過(guò) DMSO 是有毒的，所以在顯微鏡下看到細(xì)胞已經(jīng)沉淀后，請(qǐng)立即更換培養(yǎng)基。
如果 細(xì)胞解凍后將 DMSO 留在培養(yǎng)基中，那么低濃度的 dmso 對(duì)細(xì)胞的毒害程度是小的，當(dāng)我們在 5-10 ml 培養(yǎng)基中稀釋少量細(xì)胞懸液，它會(huì)進(jìn)一步稀釋 dmso。所以基本上可以排除在解凍初期DMSO對(duì)細(xì)胞的影響。

  實(shí)踐證明，如果細(xì)胞離心時(shí)，離心機(jī)速度超過(guò)1500rpm 或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，均會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的傷害。所以剛解凍的細(xì)胞離心時(shí)，離心機(jī)的速度，控制在900-1000 rpm ，4-5 分鐘就足夠了。
另外， 保存細(xì)胞的方法也很重要。如果您將細(xì)胞直接冷凍在液氮中，這也可能導(dǎo)致冷休克誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解或損壞細(xì)胞膜，防止這種情況的一種方法是逐漸降低溫度，例如在 4 度下存放幾個(gè)小時(shí)，然后轉(zhuǎn)至 -20 度過(guò)夜，然后在-70度下儲(chǔ)存幾天然后轉(zhuǎn)移到液氮罐中，按照這種循序漸進(jìn)的方法不僅可以使細(xì)胞適應(yīng)較低的溫度，還可以確保它們不會(huì)發(fā)生冷致壞死導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和裂解。

細(xì)胞凍存步驟：

1.細(xì)胞冷凍前務(wù)必檢查細(xì)胞活力。它們細(xì)胞活力至少92%以上。

2. 準(zhǔn)備好冷凍介質(zhì)（FBS 中的 10% DMSO）處于低溫狀態(tài)。

3. 將細(xì)胞以 1000 RMP 離心 5 分鐘。準(zhǔn)備標(biāo)記的低溫小瓶。細(xì)胞濃度應(yīng)約為例如從 50 毫升燒瓶中收集的約 5000 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。您可以有 10 個(gè)小瓶，每個(gè)小瓶大約有 50 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

4. 離心后，*清除培養(yǎng)基，輕輕敲擊沉淀物使其松散。用移液管加入 5 mls 的冷凍介質(zhì)重懸細(xì)胞，并將 0.5 ml 轉(zhuǎn)移到每個(gè)小瓶中。蓋緊蓋子，將低溫管放入底部有酒精的特殊低溫容器中并逐漸冷卻，它們通常最多可容納 20 個(gè)小瓶。

5. 關(guān)閉頂部并將容器轉(zhuǎn)移到-80冰箱。

細(xì)胞解凍步驟：
1.解 凍細(xì)胞的速度要快，取出裝有一些液氮的小瓶，置于水浴鍋中加溫解凍。

2. 細(xì)胞解凍時(shí)，注意保持瓶子密封，放置水浴鍋中的誰(shuí)污染細(xì)胞，同時(shí)也要避免去污劑、細(xì)菌等進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

3. 當(dāng)冷凍細(xì)胞培養(yǎng)基幾乎解凍一半時(shí)（大約幾分鐘），可向細(xì)胞中加入 0.5 份溫培養(yǎng)基，然后立即轉(zhuǎn)移到裝有約 10 至 15 毫升溫培養(yǎng)基的燒瓶中。

4. 此時(shí)DMSO被稀釋?zhuān)梢约?xì)胞活性檢查。細(xì)胞解凍結(jié)束后即可進(jìn)入下一環(huán)節(jié)的實(shí)驗(yàn)。