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色譜柱技術(shù)發(fā)展促進(jìn)了高效液相色譜法在藥物分析中更為廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜法(HPLC)已成為藥物分析,特別是多組分分析和雜質(zhì)控制中重要、廣泛的分析技術(shù)之一。由于色譜柱是液相色譜分離的核心,開(kāi)發(fā)新型或高性能的高效液相色譜填料(又稱為填充劑、固定相),提供多種色譜柱類(lèi)型一直是色譜研究中豐富、有活力、富于創(chuàng)造性的內(nèi)容。下面,我們來(lái)看看實(shí)驗(yàn)室儀器-色譜柱分類(lèi)及選購(gòu)方法。
如今,色譜柱技術(shù)的不斷改進(jìn)創(chuàng)新,填料種類(lèi)的日益豐富,分離模式和分離方法的逐步完善,為分離分析科學(xué)描繪了一幅幅絢麗的圖景新頒布的2015 年版《中國(guó)藥典》自2015 年12月1 日起正式實(shí)施。新版藥典的變化是將原來(lái)各部的附錄整合成了第四部,形成通則并對(duì)通則制定了更為合理的編碼,液相色譜法列于2015 年版《中國(guó)藥典》(四部)中通則0512 中。
在色譜分析中,如何選擇的色譜條件以實(shí)現(xiàn)理想的分離,是色譜工作者的重要工作。色譜是一種分離分析的手段,分離是核心,因此可以說(shuō)擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。因此選擇一個(gè)合適的色譜柱非常重要。
色譜柱可分正相模式色譜柱、反相模式色譜柱和親水模式柱:
正相模式色譜柱:采用極性固定相(如乙二醇、氨基與腈基等鍵合相);常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等)。
反相模式色譜柱:一般用非極性固定相,以硅膠為基質(zhì)鍵合不同的基團(tuán)(如C18、C8);適用于分離非極性和極性較弱的化合物。反相色譜(RPC)在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用多,據(jù)統(tǒng)計(jì)它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。由于超臨界色譜的崛起,一些過(guò)去用正相色譜的實(shí)驗(yàn)逐漸被超臨界色譜所代替,所以反相色譜柱的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。隨著色譜柱填料的快速發(fā)展,某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析也可用反相色譜法。為控制樣品在分析過(guò)程的解離,常用緩沖鹽控制流動(dòng)相的pH 值。硅膠基質(zhì)鍵合相(C8和C18)色譜柱使用的pH 值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH 值會(huì)使硅膠溶解,太低的pH 值會(huì)使鍵合的烷基脫落。近年來(lái)技術(shù)的更新,利用包被、空間位阻、雜化顆粒等新技術(shù),已經(jīng)可以使硅膠基質(zhì)的色譜柱使用范圍擴(kuò)大到pH 為1~12,流動(dòng)相為較強(qiáng)酸性或堿性時(shí),可選擇寬pH 值的色譜柱。
親水(HILIC)模式:HILIC不同于反相色譜技術(shù),流動(dòng)相為反相色譜的流動(dòng)相,它提供了相對(duì)于反相的互補(bǔ)選擇性,通??杀A魝鹘y(tǒng)反相色譜方法無(wú)法保留的高極性化合物。需要注意的是HILIC模式中硅膠基質(zhì)無(wú)鍵合相的色譜柱,流動(dòng)相pH 適用范圍。
對(duì)色譜柱的基礎(chǔ)要求是:柱效高、選擇性好,分析速度快等。目前市售的用于HPLC的各種色譜柱種類(lèi)繁多,從色譜柱填料來(lái)分,可分為硅膠基質(zhì)和有機(jī)雜化球基質(zhì)的色譜柱,還有不同長(zhǎng)短、不同微粒大小的色譜柱。
色譜柱的選擇可根據(jù)待分析樣品的極性、分子量大小、是否可溶于水等因素來(lái)考慮。如樣品分子量大于2000的,可溶于水的,可選擇凝膠色譜柱、大孔徑反相色譜柱、大孔徑離子交換色譜柱。分子量小于2000的,溶于有機(jī)相的,可選擇正相模式色譜柱。溶于水,可電離的樣品可選擇反相模式色譜柱或離子交換或未經(jīng)涂漬親水模式的色譜柱等。
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