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技術(shù)文章

單克隆抗體的制備

閱讀:967發(fā)布時(shí)間:2012-4-10

概述

  B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下,能夠分化、增殖形成具有針對(duì)這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細(xì)胞的這種能力和量是有限的,不可能持續(xù)分化增殖下去,因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞,再進(jìn)一步克隆化,這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤細(xì)胞的無(wú)限分裂的能力,又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力。將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠腹水內(nèi)即可獲得大量的、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。

過(guò)程

  1)免疫脾細(xì)胞的制備 制備單克隆抗體的動(dòng)物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方法同一般血清的制備,也可采用脾內(nèi)直接免疫法。

 

  2)骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選 在融合前,骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過(guò)含8-AG的培養(yǎng)基篩選,防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT的活性(恢復(fù)HGPRT的活性的細(xì)胞不能在含8-AG的培養(yǎng)基中存活)。骨髓瘤細(xì)胞用10%小牛血清的培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),融合前24h換液一次,使骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

 

  3)細(xì)胞融合的關(guān)鍵:

 

  1技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如,供者淋巴細(xì)胞沒(méi)有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。

 

  2融合試驗(yàn)zui大的失敗原因是污染,融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境,以及適宜的無(wú)菌操作技術(shù)。

 

  4)陽(yáng)性克隆的篩選 應(yīng)盡早進(jìn)行。通常在融合后10天作*次檢測(cè),過(guò)早容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。檢測(cè)方法應(yīng)靈敏、準(zhǔn)確、而且簡(jiǎn)便快速。具體應(yīng)用的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì),以及所需單克隆抗體的功能進(jìn)行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法zui簡(jiǎn)便,RIA法zui準(zhǔn)確。陽(yáng)性克隆的篩選應(yīng)進(jìn)行多次,均陽(yáng)性時(shí)才確定為陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增。

 

  5)克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體??寺』瘧?yīng)盡早進(jìn)行并反復(fù)篩選。這是因?yàn)槌跗诘碾s交瘤細(xì)胞是不穩(wěn)定的,有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株。

 

  動(dòng)物免疫

 

  細(xì)胞融合

 

  克隆篩選

 

  交雜瘤細(xì)胞的克隆化

 

  腹水制備與單抗純化

 

  關(guān)于抗體制備的詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)“中國(guó)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)網(wǎng)”。


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