金擔(dān)子素A（AbA）

金擔(dān)子素A（AbA）

金擔(dān)子素A（Aureobasidin A，AbA）是從絲狀真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分離出來的環(huán)酯肽類抗生素，具有很強(qiáng)的抗真菌能力。在較低的濃度下（0.1-0.5 μg/ml）即可對(duì)酵母產(chǎn)生毒性。對(duì)其敏感的真菌種類包括：出牙酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）和黑曲霉（A. niger.）。作用機(jī)制在于AbA抑制了真菌生長所依賴的肌醇磷酰胺（inositol phosphorylceramide，IPC）合成酶的活性，干擾鞘脂合成，從而進(jìn)一步殺死菌株。編碼IPC合成酶的基因研究較多的有來自釀酒酵母菌的AUR1 基因，以及構(gòu)巢曲霉的AURA基因，兩者具有同源性。通過對(duì)這些編碼基因進(jìn)行突變即可使得菌株對(duì)AbA產(chǎn)生抗性，如AUR1-C基因。

AbA非常適合用作陽性克隆子篩選用的藥物選擇性標(biāo)記。AbA抗性也是酵母單/雙雜交研究中理想的報(bào)告子。本品為溶于甲醇的AbA溶液，濃度為1 mg/ml。具體的工作濃度取決于宿主細(xì)胞的敏感度（見表1. AbA對(duì)各種酵母菌的低抑菌濃度（MIC））。

操作步驟（抗AbA的酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)）
1）加入0.5 ml過夜培養(yǎng)的酵母到50 ml YPD培養(yǎng)基中（配方：1L液體培養(yǎng)基含有10g yeast extract，20g polypeptone， 20g D-glucose；固體培養(yǎng)基另外加入2%瓊脂；）。
2）30℃培養(yǎng)約6小時(shí)，測定OD660為1～2。使用二倍體時(shí)，測定OD660為2～4。
3）1,000×g離心5分鐘。
4）用10 ml Solution A（配方：100 mM Lithium acetate，10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA）懸浮沉淀，1,000×g離心5分鐘。
5）用Solution A重懸沉淀，直到OD660為150。
6）在管內(nèi)分取100 µl細(xì)胞懸浮液，30℃培養(yǎng)1小時(shí)。
7）加入5 μg載體（環(huán)狀或線性DNA）和150 μg Carrier DNA（已經(jīng)過100℃加熱10分鐘，并迅速冷卻）。
【注】：pAUR101需使用線性DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用環(huán)狀DNA會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率甚至轉(zhuǎn)化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
8）加入850 µl Solution B（配方：取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 ml Solution A充分溶解，需要現(xiàn)用現(xiàn)配），輕輕混勻。
9）30℃培養(yǎng)30分鐘后，42℃培養(yǎng)15分鐘。
10）室溫放置10分鐘。
11）5,000 rpm離心1分鐘，用5 ml YPD培養(yǎng)基懸浮沉淀。
12）30℃培養(yǎng)6小時(shí)~過夜。
13）5,000~10,000 rpm離心，用1-10 ml 0.9% NaCl懸浮沉淀。
14）在YPD選擇培養(yǎng)基平板（含有一定濃度的AbA，依菌株類型而定）上接種100 µl細(xì)胞懸液。30℃培養(yǎng)3-4天后轉(zhuǎn)化完成。
15）挑取陽性轉(zhuǎn)化子，和/或測定轉(zhuǎn)化效率（以每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的菌落數(shù)來表示）。

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