本試劑盒僅供研究研究使用
 
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中NT-3含量。

實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中NT-3水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入NT-3抗原、生物素化的抗人NT-3抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的NT-3呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制5000 pg/mL標準品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標本的采集及保存
1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，為進一步去除血漿中血小板，請再次2 - 8° C 1000 x g離心10分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：血小板中含BDNF，并其將會隨著血小板的活化而釋放入血。因此欲測定循環(huán)量BDNF量，須先盡量去除標本中血小板。

操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人NT-3，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算
  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項
1． 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2． 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
3． 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。
4． 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。

說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。而且，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準。
4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
6. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
7. 所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8. 有效期：6個月