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(PCR Mycoplasma Detection Kit)
Cat number:YS012
Store at -20℃ for one year
Expire date:
For Research Use Only
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一、 試劑盒說明
本試劑盒通過PCR法對細胞培養(yǎng)物、動物分泌物等多種生物材料進行支原體污染檢測。常規(guī)培養(yǎng)法進行支原體檢測一般需要幾天的時間,而本試劑盒通過PCR擴增及電泳分析進行支原體檢測只需幾個小時,方便快捷。本試劑盒的多對引物能特異性擴增多種支原體rRNA基因片段,一次就可以檢測至少11種的支原體,包括M. fermentans,M. hyorhinis,M. arginini,M. orale,M. salivarium,M. hominis,M. pulmonis,M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA堿基序列非常保守,而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū),各種生物種間的堿基序列差別很大。這個間隔區(qū)的DNA序列及長度在支原體各個種間既有相對保守的部分,也有具有很大差異的部分。因此可以在編碼16S和23S rRNA的DNA上設(shè)計一對引物,擴增編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū),然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計一條引物,在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計一條引物進行嵌套式PCR。能特異性檢測出支原體DNA,檢測靈敏度與特異性都很高。
二、試劑盒組份
組份 | YS012(20 assays) | 儲存條件 |
10×Taq Buffer(不含Mg2+) | 1.0 mL | -20℃ |
MgCl2(25mM) | 1.0 mL | -20℃ |
Taq DNA Polymerase(5 U /μl) | 100 U | -20℃ |
Myc F1 Primer (10μM) | 50μL | -20℃ |
Myc R1 Primer(10μM) | 50μL | -20℃ |
Myc F2 Primer(10μM) | 50μL | -20℃ |
Myc R2 Primer(10μM) | 50μL | -20℃ |
Control Template(1 ng/μl) | 50μL | -20℃ |
DNA溶解液 | 2 mL | -20℃ |
ddH2O | 5 mL | -20℃ |
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
離心機、微量移液器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、dNTPs(10mM)、瓊脂糖、溴化乙錠等
四、使用注意事項
整個實驗,應(yīng)規(guī)范操作,反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣、PCR擴增應(yīng)分區(qū)域進行,以避免交叉污染。
五、 操作方法
1.收取待檢樣品(細胞一般生長至80%左右即可,貼壁細胞不宜用消化液消化細胞,可以使用細胞刮刮取細胞),然后取細胞懸液200ul(約1~3×105細胞數(shù))至離心管,12000rpm離心5~10min;去上清,加入50ul DNA溶解液,充分懸浮沉淀物,沸水浴5min;樣品使用前12000rpm離心5~10min,取上清4ul作為PCR反應(yīng)模板;剩余樣品可以-20℃保藏。樣本有時也可以直接用污染液直接做PCR反應(yīng)。
2.PCR反應(yīng)
*步PCR:
50μL體系PCR反應(yīng)(如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系,試劑加樣量按比例進行減少):
(1).使用前每個組份輕輕混勻,然后2000rpm離心20s;
(2).取滅過菌的0.2mL離心管,在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs (10mM) 1 μL
MgCl2 (25mM) 4 μL
Myc F1 (10μM) 1 μL
Myc R1 (10μM) 1 μL
DNA樣品 1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
(3).輕輕混勻,2000rpm離心20s;
(4).進行PCR擴增
PCR擴增條件:
94°C,5min;
94°C,30 sec;55°C,2min;72°C,1 min;32 Cycles;
72°C,10 min,
第二步PCR:
50μL體系PCR反應(yīng)(如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系,試劑加樣量按比例進行減少):
(1).使用前每個組份輕輕混勻,然后2000rpm離心20s;
(2).取滅過菌的0.2mL離心管,在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs (10mM) 1 μL
MgCl2 (25mM) 4 μL
Myc F2 (10μM) 1 μL
Myc R2 (10μM) 1 μL
*步產(chǎn)物 1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
(3).輕輕混勻,2000rpm離心20s;
(4).進行PCR擴增
PCR擴增條件:
94°C,5min;
94°C,30 sec;55°C,2min;72°C,1 min;32 Cycles;
72°C,10 min,
3.反應(yīng)結(jié)束后,取反應(yīng)液10μL進行瓊脂糖凝膠電泳,確認PCR反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR產(chǎn)物需用于以后實驗,應(yīng)將PCR產(chǎn)物冷凍保存。
4.根據(jù)感染支原體類型的不同,擴增產(chǎn)物大小有所不同,*步PCR產(chǎn)物在350~700bp 之間,第二步PCR產(chǎn)物在150~250bp之間。
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