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上海彩佑生物發(fā)展有限公司

支原體污染檢測試劑盒(PCR法)說明書

時間:2012-10-9閱讀:687
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支原體污染檢測試劑盒(PCR

(PCR Mycoplasma Detection Kit)

Cat numberYS012

Store at -20 for one year

Expire date

For Research Use Only

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一、 試劑盒說明

本試劑盒通過PCR法對細胞培養(yǎng)物、動物分泌物等多種生物材料進行支原體污染檢測。常規(guī)培養(yǎng)法進行支原體檢測一般需要幾天的時間,而本試劑盒通過PCR擴增及電泳分析進行支原體檢測只需幾個小時,方便快捷。本試劑盒的多對引物能特異性擴增多種支原體rRNA基因片段,一次就可以檢測至少11種的支原體,包括M. fermentansM. hyorhinis,M. argininiM. orale,M. salivariumM. hominis,M. pulmonis,M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA堿基序列非常保守,而rRNA操縱子上編碼rRNADNA間隔區(qū)如16S23S間隔區(qū),各種生物種間的堿基序列差別很大。這個間隔區(qū)的DNA序列及長度在支原體各個種間既有相對保守的部分,也有具有很大差異的部分。因此可以在編碼16S23S rRNADNA上設(shè)計一對引物,擴增編碼16S23S rRNADNA間隔區(qū),然后在編碼16S23S rRNADNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計一條引物,在編碼23S rRNADNA上設(shè)計一條引物進行嵌套式PCR。能特異性檢測出支原體DNA,檢測靈敏度與特異性都很高。

二、試劑盒組份

組份

YS012(20 assays

儲存條件

10×Taq Buffer不含Mg2

1.0 mL

-20

MgCl225mM

1.0 mL

-20

Taq DNA Polymerase5 U /μl

100 U

-20

Myc F1 Primer (10μM)

50μL

-20

Myc R1 Primer(10μM)

50μL

-20

Myc F2 Primer(10μM)

50μL

-20

Myc R2 Primer(10μM)

50μL

-20

Control Template(1 ng/μl)

50μL

-20

DNA溶解液

2 mL

-20

ddH2O

5 mL

-20

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

離心機、微量移液器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、dNTPs(10mM)、瓊脂糖、溴化乙錠等

四、使用注意事項

整個實驗,應(yīng)規(guī)范操作,反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣、PCR擴增應(yīng)分區(qū)域進行,以避免交叉污染。

五、 操作方法

1.收取待檢樣品細胞一般生長至80%左右即可,貼壁細胞不宜用消化液消化細胞,可以使用細胞刮刮取細胞,然后取細胞懸液200ul(13×105細胞數(shù)至離心管,12000rpm離心510min;去上清,加入50ul DNA溶解液,充分懸浮沉淀物,沸水浴5min;樣品使用前12000rpm離心510min,取上清4ul作為PCR反應(yīng)模板;剩余樣品可以-20℃保藏。樣本有時也可以直接用污染液直接做PCR反應(yīng)。

2.PCR反應(yīng)

*步PCR

50μL體系PCR反應(yīng)如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系,試劑加樣量按比例進行減少

1.使用前每個組份輕輕混勻,然后2000rpm離心20s

2.取滅過菌的0.2mL離心管,在冰上依次加入

10×Taq Buffer                   5  μL

dNTPs (10mM)                  1  μL

MgCl2 (25mM)                  4  μL

Myc F1 (10μM)                 1  μL

Myc R1 (10μM)                 1  μL

DNA樣品                      1~5 μL

Taq DNA Polymerase             0.5 μL

ddH2O up to                     50 μL

3.輕輕混勻,2000rpm離心20s

4.進行PCR擴增

PCR擴增條件:

94°C,5min;

94°C30 sec;55°C2min;72°C,1 min32 Cycles;

72°C,10 min

第二步PCR

50μL體系PCR反應(yīng)如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系,試劑加樣量按比例進行減少

1.使用前每個組份輕輕混勻,然后2000rpm離心20s;

2.取滅過菌的0.2mL離心管,在冰上依次加入

10×Taq Buffer                   5  μL 

dNTPs (10mM)                  1  μL

MgCl2 (25mM)                  4  μL

Myc F2 (10μM)                 1  μL

Myc R2 (10μM)                 1  μL

*步產(chǎn)物                    1~5 μL

Taq DNA Polymerase             0.5 μL

ddH2O up to                     50 μL

3.輕輕混勻,2000rpm離心20s;

4.進行PCR擴增

PCR擴增條件:

94°C5min;

94°C30 sec;55°C2min;72°C,1 min;32 Cycles;

72°C,10 min

3.反應(yīng)結(jié)束后,取反應(yīng)液10μL進行瓊脂糖凝膠電泳,確認PCR反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR產(chǎn)物需用于以后實驗,應(yīng)將PCR產(chǎn)物冷凍保存。

4.根據(jù)感染支原體類型的不同,擴增產(chǎn)物大小有所不同,*步PCR產(chǎn)物在350700bp 之間,第二步PCR產(chǎn)物在150250bp之間。

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