[方法]
1．設(shè)計(jì)并合成含有CDR3隨機(jī)化序列的VHFOR引物。 當(dāng)然必須以擬進(jìn)行親和力成熟的 抗體VH基因作為設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。本例中，VHCDR3的7個(gè)氨基酸被隨機(jī)化。在每個(gè)隨機(jī)化位點(diǎn)中，保留了大約50％野生型氨基酸。引物設(shè)計(jì)結(jié)果如下：
VHFOR隨機(jī)引物： 5’—CC CTG GCC CCA GTAGTC AAA 532 511 532 544 524 534 514 TTT CGC ACA GTA ATA AAC GGC—3，
隨機(jī)化了7個(gè)連續(xù)的CDR殘基。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出以下結(jié)論：只有當(dāng)溶劑可接近殘基突變時(shí)，序列空間才能被更有效地利用。采用分子建?？梢宰R(shí)別出這些殘基。本例中隨機(jī)化殘基的選擇就是根據(jù)分子建模的方法預(yù)測(cè)哪些殘基具有溶劑可接近側(cè)鏈的。
2．配制2個(gè)50ul PCR反應(yīng)混合液，1個(gè)用于VH基因的擴(kuò)增． 另1個(gè)用于VL基因的擴(kuò)
增，包含：
● 水，35．5ul
● 20XdNTP， 2．5ul
● 10XVent聚合酶緩沖液，5．0ul
● 反向引物（10pmol／ul），2．5ul
● 正向引物（10pmol/ul），2．5ul
● scFv基因模板DNA（100ng），1．0ul
● Vent DNA聚合酶（2單位），1．0ul
3．在有加熱蓋的熱循環(huán)儀內(nèi)加熱試管到94℃5分針。以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃ 2分鐘的條件共循環(huán)30次，擴(kuò)增V”基因和Vl基因。
4．用1．5％瓊脂糖膠純化Vu基因丈庫[350個(gè)堿基對(duì)（bp）]和VL基因 （320bp）；用 Geneclean試劑盒提取0NA。將每種產(chǎn)物重懸于30ul水中。在1．5％瓊脂糖凝膠上與已知大小和農(nóng)度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品比較，測(cè)定DNA濃度。