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利用密度梯度方法進(jìn)行核糖體分離
點擊次數(shù)：6248 發(fā)布時間：2012-10-8
核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的場所，也是細(xì)胞中含量zui多的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，在真核生物中數(shù)目龐大。核糖體除參與蛋白質(zhì)合成外，還與細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞壽命、胚胎發(fā)育以及癌癥的發(fā)生有關(guān)，在快速生長的酵母細(xì)胞中，細(xì)胞花費了大部分的能量用于產(chǎn)生、組裝成熟核糖體的相關(guān)成分，與核糖體生物發(fā)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄占到整個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體系的60%以上。
除此之外，還可通過對核糖體的研究間接了解到某些基因的表達(dá)活性或在不同的脅迫條件下，特定基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的變化。通過結(jié)合于核糖體亞基和多聚核糖體上的RNA，利用qRT-PCR技術(shù)，可以直接了解到基因的表達(dá)活性。如何實現(xiàn)核糖體的分離，獲得相關(guān)信息成為了核糖體研究的關(guān)鍵。以下為利用密度梯度方法進(jìn)行核糖體分離的相關(guān)流程及方法，可供核糖體研究的相關(guān)人員參考。
在密度梯度液的制備過程中，由于層鋪法產(chǎn)生的是點梯度，分離效果差，故采用Biocomp公司生產(chǎn)的全自動密度梯度制備儀進(jìn)行*線性密度梯度溶液的制備。在SW41離心管中先加入1/2體積10%蔗糖溶液，再由針頭插入底部加入1/2體積45%蔗糖梯度液（每個梯度液加入量以Biocomp提供的標(biāo)尺為準(zhǔn)），放置于Biocomp梯度制備儀中，選擇相應(yīng)的內(nèi)置程序（轉(zhuǎn)子為SW41，梯度介質(zhì)為蔗糖，梯度范圍為10-45%）運行，便可直接獲得10-45%*線性蔗糖梯度溶液。
關(guān)于細(xì)胞樣品的處理，以培養(yǎng)的Hela細(xì)胞為例，先用PBS（pH 7.4）洗兩次，然后加入細(xì)胞裂解緩沖液，緩沖液包含50mM Tris-HCL，100mM KCL（或NaCl），5mM MgCl2，1mM DTT，100ug/ml cycloheximide（環(huán)己酰亞胺），40U/ml RNasin，以及1% NP-40和1% sodium deoxycholate（脫氧膽酸鈉）。
裂解后的細(xì)胞，首先對細(xì)胞裂解液進(jìn)行預(yù)離心，4℃，10000-13000rpm離心10min，然后取上清液上樣于10-45%蔗糖密度梯度溶液中，梯度液包含20mM Tris-HCl（pH 7.5），5mM MgCl2, 100mM NaCl以及50ug/ml cycloheximide。對于核糖體的分離多依據(jù)各組分的沉降系數(shù)的不同，因此采用速度區(qū)帶離心方法。放置離心管于Beckman超速離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速36000-40000rpm，4℃離心2-3h，使得核糖體亞基及多聚核糖體在梯度溶液中得到分離。
核糖體分離后的收集及繪圖，手動方法收集易產(chǎn)生分層的擾動，且無法繪制吸收峰圖。故采用Biocomp全自動密度梯度分離系統(tǒng)進(jìn)行收集，結(jié)合紫外檢測器，檢測樣品在260nm處的吸收，實時繪制吸收峰圖。利用餾分收集器進(jìn)行分管收集樣品，通過吸收峰圖對應(yīng)的離心管號，便可以直接獲得各核糖體亞基或多聚核糖體上的RNA，結(jié)合qRT-PCR等技術(shù)可進(jìn)行進(jìn)一步相關(guān)研究。
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