實(shí)驗(yàn)原理

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門(mén)新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

雜交所用的探針大致可以分類三類：1）染色體特異重復(fù)序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號(hào)強(qiáng)，易于檢測(cè)；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。
探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用*標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用親和素-*-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)500bp的片段。而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。

實(shí)驗(yàn)用具及材料

相關(guān)溶液的配制

1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L NaOH調(diào)pH 至7.0）。

2）去離子甲酰胺（DF）：將10g混合床離子交換樹(shù)脂加入100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，用Whatman l號(hào)濾紙濾。

3）體積分?jǐn)?shù)70％甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4）體積分?jǐn)?shù)50％甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5）體積分?jǐn)?shù)50％硫酸葡聚糖（DS）：65oC水浴中融化，4oC或-20oC保存。

6）雜交液：8µL體積分?jǐn)?shù)25％DS，20µL 20×SSC混合。（或40µL體積分?jǐn)?shù)50％DS，20µL 20×SSC，40µL ddH2O混合）取上述混合液50µL，與5µL DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10％DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50％DF。

7）PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100µg/mL，取出1mL，加39mL雙蒸水，使終濃度為2.5µg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10mg/mL,用0.5mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，－20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲(chǔ)存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

9）封閉液I：體積分?jǐn)?shù)5％BSA 3mL，20×SSC 1mL,ddH2O 1mL,Tween20 5µL混合。

10）封閉液II：體積分?jǐn)?shù)5％ BSA 3mL,20×SSC 1mL,goat serum 250µL,ddH2O 750µL,Tween20 5µL混合。

11）熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5％ BSA 1mL，20×SSC 1mL,ddH2O 3mL,Tween20 5µL混合。

12）洗脫液：100mL 20×SSC，加水至500mL，加Tween20 500µL。