實(shí)驗(yàn)試劑
 

YEB液體培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，0.1 M CaCl2 ，0.05 M MgSO4 ，花浸泡緩沖液（0.5XMS，5%蔗糖，0. 03%Silwet L-77 ），Rif，Kan

實(shí)驗(yàn)設(shè)備
 

搖床，離心機(jī)，培養(yǎng)缽，溫室，托盤(pán)，塑料薄膜

實(shí)驗(yàn)材料
 

已構(gòu)建好的表達(dá)載體，擬南芥

實(shí)驗(yàn)步驟
 

1. 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

1） 挑取GV1301單菌落于10 ml YEB或者LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期；

2） 取0.5 ml菌液加入50 ml新鮮YEB或者LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5；

3） 轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，冰浴20 min；

4） 轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，冰浴20 min；

5） 4℃，4000 rpm離心10 min，收集菌體；

6） 沉淀用8 ml預(yù)冷的0.1 M CaCl2 和0.05 M MgSO4 重懸；

7） 4℃，4000 rpm離心10 min，收集菌體；

8） 取200 ul感受態(tài)細(xì)胞，加入0.5 ug質(zhì)粒，輕輕混勻；

9） 液氮冷凍50 s，冰上放置40 min，42℃熱激90 s；

10） 加入800 ul LB培養(yǎng)基，28℃恢復(fù)培養(yǎng)1 hr；

11） 涂布適量的細(xì)胞于篩選培養(yǎng)基上，超凈臺(tái)吹干表層液體；

12） 28℃培養(yǎng)兩天。

2. 花浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥

1） 接種含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌克隆于5ml YEB培養(yǎng)基（含100 ug/ml Rif，100 ug /ml Kan）中，28℃，200 rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

2） 按1：50的比例轉(zhuǎn)接到200 ml YEB培養(yǎng)基中28℃，200 rpm培養(yǎng)5 hr；5000 X g，離心15 min，收集菌體；重懸于花浸泡緩沖液（0.5XMS，5%蔗糖，0. 03%Silwet L-77 ），調(diào)OD600 至0. 8。

3） 將擬南芥培養(yǎng)缽倒置于裝有花浸泡緩沖液的合適大小的容器上，浸泡3-5min，取出培養(yǎng)缽倒置于托盤(pán)中，用塑料薄膜覆蓋托盤(pán)，24 hr后取下薄膜，于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。