蛋白質(zhì)純化技術(shù)服務(wù)

1、 蛋白質(zhì)純化服務(wù)流程

① 原始材料的澄清;

② 目的重組蛋白的捕獲(GST、His標(biāo)簽蛋白);

③ 破碎含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞;

④ 蛋白質(zhì)粗提，清除雜質(zhì):去除核酸、原生質(zhì)體、不溶物或者洗滌包涵體等;

⑤ 變性、濃縮;

⑥ 純化：離子交換層析、親和柱層析(帶標(biāo)簽的融合蛋白)、凝膠過(guò)濾等;

⑦ 精制均一的目的蛋白;

⑧ 蛋白質(zhì)純度鑒定;

⑨ 蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

2、 蛋白質(zhì)純化的方法

蛋白質(zhì)純化的現(xiàn)有方法范圍很廣，從19世紀(jì)簡(jiǎn)單沉淀到復(fù)雜層析和親和技術(shù)。方法可被分成幾種不同的類(lèi)別，如根據(jù)蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，可以將蛋白質(zhì)純化方法分成明顯不同但又相互關(guān)聯(lián)的4組：表面特征、結(jié)構(gòu)、凈電荷和生物學(xué)特性。

①基于蛋白質(zhì)表面特征的方法：表面特征包括電荷分布和可及性、疏水氨基酸殘基鏈的表面分布以及在較少程度上蛋白質(zhì)在某pH時(shí)的凈電荷。該法主要依賴于溶解度的特性，通過(guò)對(duì)溶解蛋白質(zhì)的溶劑進(jìn)行各種處理，使蛋白質(zhì)的溶解度發(fā)生變化，從而引起沉淀，獲得含有大量可溶性目的蛋白提取物。在這組方法中還包括高度特異性的免疫親和層析技術(shù)，使用直接抗蛋白質(zhì)表面上一個(gè)表位的抗體從混合物中將目的蛋白分離出來(lái)。

②基于整個(gè)結(jié)構(gòu)(大小和形狀)的方法：利用蛋白質(zhì)的大小和形態(tài)的分離主要采用凝膠過(guò)濾法。蛋白質(zhì)大小的范圍很大，從zui小的分子質(zhì)量約5000 Da的蛋白質(zhì)(被分類(lèi)為蛋白質(zhì)，而不是肽)到幾百萬(wàn)道爾頓的大分子物。許多蛋白質(zhì)在具有生物活性的狀態(tài)下為寡聚體，由一個(gè)以上的多肽組成，這種寡聚體可以被解離。

③基于凈電荷的方法：利用蛋白質(zhì)全部?jī)綦姾傻膬煞N技術(shù)是離子交換層析和電泳。離。離子交換劑結(jié)合帶電荷的分子，而且基本只有兩種離子交換劑：陰離子和陽(yáng)離子。，離子交換劑由固定化的帶電基團(tuán)組成，能夠吸引帶不同電荷的蛋白質(zhì)，這些離子交換劑能夠提供對(duì)天然蛋白質(zhì)具有zui高分辨率的分離(圖1)。

④基于生物學(xué)特性的方法(親和法)：從其他蛋白質(zhì)中分離目的蛋白的一種強(qiáng)有力的方法是使用生物特異性的方法。除了從理論上能夠通過(guò)免疫親和層析進(jìn)行純化蛋白質(zhì)以外，親和法只局限于具有某種特異結(jié)合特性的蛋白質(zhì)，免疫親和層析是所有親和技術(shù)中zui特異的。在親和層析技術(shù)中，將與蛋白質(zhì)結(jié)合的配體(或能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體)固定化，則能夠選擇性地吸附目的蛋白(圖2)。

圖1 離子交換原理 圖2 親和層析原理

3、 蛋白質(zhì)純化的原則

①確定zui終目的：確定zui終目的蛋白的純度水平和所需要的量;

②建立一種快速的分析方法：該方法可監(jiān)控目的蛋白的純度，快速檢測(cè)目的蛋白的活性和每一步驟中的回收率，分析也應(yīng)能容易地處理大量樣品;

③在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定目的蛋白的化學(xué)特性和物理特性:如pI、大小、溫度穩(wěn)定性和配基專一性等，以利于簡(jiǎn)化分離技術(shù)的選擇和*化,可能的話，在每一純化階段采用不同的分離技術(shù);

① 保持純化操作盡可能簡(jiǎn)化：額外的步驟總會(huì)減少目的蛋白的產(chǎn)率，也會(huì)增加整個(gè)過(guò)程的時(shí)間;

② 每一步驟要處理盡量少的樣品：避免冗長(zhǎng)的操作，否則可能會(huì)減少產(chǎn)率，導(dǎo)致生物活性的丟失;

③ 在純化操作的早期除去危險(xiǎn)污染物，特別是蛋白酶;

④ 加穩(wěn)定性添加劑要小心，如去污劑和鹽，因?yàn)榭赡苄枰谝院蟮募兓襟E中除去這些添加劑，否則它們可能會(huì)干涉分析。

4、 材料要求

① 盡量選用新鮮的材料;

② 實(shí)驗(yàn)材料涉及危險(xiǎn)品，loogene公司不予服務(wù);

③ 提供盡量詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)背景材料;

④ 大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，注意選含量高、來(lái)源豐富及成本低的原料;

⑤ 對(duì)預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 應(yīng)冷凍保存。

5、 實(shí)驗(yàn)周期

① 純化1～5mg蛋白質(zhì)，20個(gè)工作日

② 純化5～10mg蛋白質(zhì)，30個(gè)工作日

③ 純化10mg蛋白質(zhì)以上，40個(gè)工作日

6、 提供結(jié)果

完整的實(shí)驗(yàn)操作步驟、目的蛋白質(zhì)純度鑒定(85%，90%，95%)、目的蛋白質(zhì)含量鑒定等。