核苷酸

濃氨水TBE丙烯酰胺亞甲雙丙烯酰胺TEMED尿素過(guò)硫酸銨TE

真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀電泳儀

2.  樣品移至離心管中，在Speedvac真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中凍干，沉淀用0.2 ml 的水重懸。

3.  裝好灌膠裝置，準(zhǔn)備合適的凝膠溶液（表1）。對(duì)于10 cm×16 cm×1.6 mm 大小的凝膠，在一個(gè)真空過(guò)濾瓶中棍合下列成分：

（1）25.2 g  尿素（終濃度7 mol/l）

（2）6 ml 10×TBE  電泳緩沖液

（3）40%丙烯酰胺/2%亞甲雙丙烯酰胺溶液（所需量）

（4）加水至60 ml

（5）脫氣10 min，加入200 μl10%的過(guò)硫酸銨及30 μl 的TEMED。混合后灌膠，室溫下讓膠聚合30 min 以上。
 

表1、變性聚丙胺凝膠電泳能使相應(yīng)片段達(dá)到zui適分離度的丙烯酰胺濃度

4.  拔去梳子，將凝膠板固定在電泳槽上，用1×TBE下緩沖液注滿上層及下層槽。

5.  加樣前用2×甲酰胺加樣緩沖液將樣品作對(duì)倍稀釋。

6.  每一個(gè)2 cm×1.6 mm 孔中可以加入2 μmol 合成量的25%。

7.  得到一個(gè)清哳的結(jié)果約需10 μg（50 μl 重懸樣品+50 μl 2×甲酰胺加樣緩沖液=每孔100 μl）。

8.  臨加樣前用移液器上下吹打TBE緩沖液數(shù)次以*洗滌樣品孔。

9.  加樣，在約5 V/cm²電壓降下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部。

10.  將凝膠板從電泳槽中取出，水平放置，撬開(kāi)上層板。

11.  用塑料膜覆蓋凝膠，將板翻轉(zhuǎn)，將凝膠的一角揭離玻璃板，放在塑料膜上，再用另一張塑料膜覆蓋凝膠。

12.  將凝膠放在帶熒光指示劑的薄層層析板上，用短波紫外燈跟蹤觀察條帶，條帶將在綠色背景下顯示暗跡。

13.  一個(gè)干凈的*將條帶直接切下或用墨水標(biāo)記后切出，剝?nèi)ニ芰夏?，將膠條轉(zhuǎn)移至離心管中。

14.  每2 cm 的膠條加0.5 ml 的0.3 mol/l 乙酸鈉，室溫下在旋轉(zhuǎn)揺床上洗脫過(guò)夜。

15.  將溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的離心管中，不要帶入丙烯酰胺碎片。

16.  用等體積的酚抽提1次，氯仿抽提1次，乙醇沉淀，干燥，樣品用TE緩沖液或水重懸。