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技術(shù)文章
磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞
點(diǎn)擊次數(shù)：1540 發(fā)布時(shí)間：2012-7-27
磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞
一.試劑配制
無菌水ddw： 高溫滅菌； 分裝；
2XHBS： 280mM NaCl
10mM KCl
1.5 mM Na2HPO4
12 mM glucose
50 mM HEPES
Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 過濾滅菌，分裝；
2M CaCl2： 過濾滅菌，分裝。
二. 實(shí)驗(yàn)過程：
1. 鋪細(xì)胞： 選擇狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代， 2-3x105個(gè)細(xì)胞/35mm dish。
2. 20-24h后，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿瓶底約50-70%的時(shí)候，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。下面就35mm dish為例，采用以下轉(zhuǎn)染體系：
ddw： 105ul
plasmid： 2 ug （如0.5ug/ul， 即用4ul）
2M CaCl2： 16.5ul
2XHBS： 125ul
按上述順序，往eppendorf管中依次加入上述四種試劑。
先將前三者混勻， zui后加2XHBS。
一種方法是，加2XHBS時(shí)要逐滴加入， 吹打至微現(xiàn)乳白色， 立即均勻滴入培養(yǎng)皿，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中，6-8h后換液。
另一種方法是， 加入2XHBS后立即吹打約40下（不過這個(gè)要根據(jù)每個(gè)人的力道和吹打的頻率而定， 建議做一個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)，吹打不同的次數(shù)看哪次的轉(zhuǎn)染效率高以后就按這個(gè)次數(shù)來吹打）， 之后步驟同上， 立即均勻滴入培養(yǎng)皿，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中，6-8h后換液。