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1  材料

1.1 動(dòng)物

出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。

 

1.2 試劑

低糖 DMEM、*（含 EDTA）、青*、*液、新生牛血清、*、D-Hank's 液。0.1%新潔爾滅、碘酒、75%酒精。

培養(yǎng)液：培養(yǎng)液（DMEM，新生牛血清，青*）。

 

1.3 手術(shù)器械和儀器

鋁盒、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎剪、玻璃培養(yǎng)皿（共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心臟組織）、100 ml 廣口瓶?jī)蓚€(gè)（分別裝碘酒和酒精棉球）、500 ml 燒杯、250 ml 錐形瓶、15 ml和 50 ml 的離心管，磁力攪拌器和攪拌子（或者水浴振蕩器）、150-200 目尼龍篩網(wǎng)和針式濾器。

 

2  方法

2.1 將*用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度，并放置于 37℃水浴中溫育好。

 

2.2 解剖取材：將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開(kāi)皮，充分撕拉開(kāi)，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開(kāi)肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來(lái)。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復(fù)以上過(guò)程。取材完畢后，撤掉取材的手術(shù)器械。注：為了保證心肌細(xì)胞的活力，取心的操作過(guò)程盡量快，另外，把盛的心臟的培養(yǎng)皿放置在冰臺(tái)上或者預(yù)冷的平衡鹽液中。

 

2.3 用第二套手術(shù)器械進(jìn)行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個(gè)預(yù)先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個(gè)培養(yǎng)皿中（或者其它合適容器中，視個(gè)人習(xí)慣），加少許 0.06%*，用眼科彎剪將心臟*成 1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和*液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鮮的*沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶中，補(bǔ)加*至終體積10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中（可以用一個(gè)消毒的500 ml燒杯，裝好無(wú)菌的蒸餾水，加夠水量，水位線(xiàn)稍低于250 ml錐形瓶的刻度線(xiàn)即可，過(guò)少則溫度會(huì)不均勻，過(guò)高容易污染。打開(kāi)磁力攪拌器電源，預(yù)先將水溫調(diào)節(jié)到 37℃），調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 60 rpm左右，消化15 min（務(wù)必保證水浴溫度恒定在 37℃，并且消化時(shí)間不超過(guò) 15 min）?；蛘撸绻捎玫氖撬≌鹗幤鞯脑?huà)，不用加攪拌子，直接放在水浴震蕩器中消化亦可，轉(zhuǎn)速和消化時(shí)間相同。

 

2.4  從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細(xì)胞和成纖維類(lèi)細(xì)胞。

 

2.5  加入10 ml 新的*，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機(jī)械分散細(xì)胞（組織消化后會(huì)成為粘稠的膠體狀），注意：不要過(guò)分吹打，否則會(huì)導(dǎo)致組織過(guò)度消化，37℃水浴攪拌再消化 10-15 min；如果乳鼠數(shù)目少（比如 5、6 只的時(shí)候），消化時(shí)間可以減少為 5-10 min，否則很容易消化過(guò)度。上述消化處理的同時(shí)，往一支 50 ml 的一次性無(wú)菌離心管中加入 20 ml 預(yù)冷的含 10%血清的培養(yǎng)液，并放置冰臺(tái)上。消化處理之后，小心移出上清轉(zhuǎn)至上述加有培養(yǎng)液的離心管中，*次消化收集的分離出的細(xì)胞，*次消化結(jié)束后；繼續(xù)第二次消化，余下的組織塊加入 10 ml 新*繼續(xù)消化。

 

2.6  重復(fù) 2.5 消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化 4-5 次可以消化絕大多數(shù)的組織塊（不含棄去消化液的那次）。

 

2.7  第 1、2 次含細(xì)胞的消化液放在一根離心管中，過(guò) 180 目篩網(wǎng)后，一起離心；第 3、4 次含細(xì)胞的消化液放在一根離心管中，過(guò) 180 目篩網(wǎng)后，一起離心。zui后，分別用 8 ml含 20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細(xì)胞，接種到一個(gè) 75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中 1.5 小時(shí)后，取出，棄貼壁細(xì)胞（主要是成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞），將未貼壁的細(xì)胞懸液取出，臺(tái)盼籃拒染法計(jì)數(shù)后，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5-6x105個(gè)/ml，接種到目的培養(yǎng)器皿中。

 

2.8  一般不用加BrdU，如果培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)（發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞也極少），可以加入 0.1 mmol/ml BrdU（Sigma）以阻止成纖維細(xì)胞增殖。加了BrdU，心肌細(xì)胞搏動(dòng)的持續(xù)時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)。

 

2.9  接種后 24 小時(shí)，用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細(xì)胞一次，以去處未貼壁的細(xì)胞（部分細(xì)胞會(huì)在 24 小時(shí)后貼，結(jié)果很多細(xì)胞重疊生長(zhǎng)），再更換培養(yǎng)液，即可?？梢园凑諏?shí)驗(yàn)需要在培養(yǎng) 48 h 或 72 h 后施加處理因素。

 

3  結(jié)果

心肌細(xì)胞剛接種時(shí)形狀為圓形或橢圓形，大約在 24 h左右基本貼壁，此時(shí)細(xì)胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細(xì)胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細(xì)胞有聚集傾向，細(xì)胞搏動(dòng)效果較好， DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時(shí)為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應(yīng)該是營(yíng)養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。我們也參考了一些國(guó)外文獻(xiàn)的培養(yǎng)方法加以補(bǔ)充。鑒定的zui簡(jiǎn)單的辦法就是搏動(dòng)與否，注意：當(dāng)搏動(dòng)比較微弱的時(shí)候，在 10 倍物鏡下可能看不到搏動(dòng)，換成20 或40倍的物鏡可能能觀(guān)察到。檢驗(yàn)操作是否合格的的辦法就是看心肌細(xì)胞的純度和搏動(dòng)能力。另外，心肌細(xì)胞表達(dá)肌動(dòng)蛋白，可以作為鑒定，但不是*的特征性指標(biāo)，因?yàn)槠交〖?xì)胞也表達(dá)。

 

4  討論

乳鼠心肌細(xì)胞屬于原代生長(zhǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程較為繁瑣。文獻(xiàn)上有多種濃度*消化方法，0.06%濃度的*對(duì)細(xì)胞損害較小，但這個(gè)濃度消化所需時(shí)間較長(zhǎng)。采取多次反復(fù)低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細(xì)胞。利用心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同，采用差速貼壁 1.5h，充分去除成纖維類(lèi)細(xì)胞，達(dá)到純化的目的。成纖維細(xì)胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，*有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀，并且會(huì)增殖，不搏動(dòng)，很好和心肌細(xì)胞鑒別。消化和吹打一定不要過(guò)度，是保證心肌細(xì)胞活力zui重要的一個(gè)原則。而接種密度（一般不低于 105/ml），也將影響到心肌細(xì)胞的搏動(dòng)及同步化搏動(dòng)。