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凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系列二-實(shí)驗(yàn)操作方法
點(diǎn)擊次數(shù)：234 發(fā)布時(shí)間：2012-10-16
凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系列二-實(shí)驗(yàn)操作方法
1.探針的標(biāo)記：
（1） 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：
待標(biāo)記探針 （1.75pmol/微升） 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升
總體積 10微升
按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。
（2） 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。
（3） 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。
（4） 再加入89微升TE,混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。
（5） 標(biāo)記好的探針立即使用，zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。
2.探針的純化：
通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：
（1） 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。
（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀過夜。
（3） 在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。
（4） 在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。
（5） 加入100微升TE，*溶解沉淀。標(biāo)記好的探針立即使用，zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃。