激情综合啪啪6月丁香,久久久久国产精品91福利,99精品日韩欧美在线观看,91成人午夜福利在线观看国产

原代培養(yǎng)中成纖維細胞的抑制

成纖維型細胞：在培養(yǎng)中的細胞凡形態(tài)與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)相似而得名，細胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細胞*有卵園形核，胞質(zhì)向外伸出2-3 厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細胞常呈本類形態(tài)生長。
培養(yǎng)細胞的純化
【我是小米2】培養(yǎng)細胞的純化：
1、自然純化
即利用某一種類細胞的增殖優(yōu)勢，而排擠其他細胞生長，靠自然的增值潛力zui后留下生長優(yōu)勢細胞，去除其他細胞。有些惡性腫瘤細胞可以通過此方法，自然純化建立細胞系。
2、人工純化
（1）酶消化法
在消化培養(yǎng)細胞時，常是成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，特別是在原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期這種差別尤為明顯，因而可以利用這種差異采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開。
（2）機械劃除法
原代培養(yǎng)成功后，上皮細胞和成纖維細胞所數(shù)都同時出現(xiàn)，混雜生長。這種混雜生長常常分區(qū)成片，每種細胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上。因此可以采用機械的方法去除不需要的細胞。
（3）反復貼壁法
成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞常能在短時間內(nèi)大約10－30min完成附著過程，而上皮細胞大部分在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細胞。
（4）克隆法
采用細胞克隆法將細胞分成單個細胞，使之分別生長成克隆，選擇出所需要的克隆。
（5）培養(yǎng)及限定方法
某些細胞在生長過程中必須存在或必須去除某種物質(zhì)，否則無法生長，可以利用這種技術(shù)來純化細胞。
（6）流式分選
brdu
【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纖維細胞的生長，便宜易買到的
【snany】阿糖孢苷效果不是特別理想
【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁細胞原代培養(yǎng)的文獻中看到的：成纖維細胞大量生長是壁細胞分離培養(yǎng)失敗的常見原因。培養(yǎng)基中加入血清會刺激成纖維細胞而抑制壁細胞生長，對壁細胞可能還有一定的毒性作用。為了減少成纖維細胞的生長，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培養(yǎng)液，時差貼壁30-45分鐘，除去成纖維細胞，然后再換用無血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。不知道你有沒有用？試試吧。
【sxtyzyq2】買sigma公司的brdu然后把它配成終濃度為1 mmol/l然后1ml培養(yǎng)液中加入5微升就可抑制成纖維細胞
【gfeng8078】我是養(yǎng)心肌原代，也需要抑制成纖維細胞，請問各位大俠，5-brdu用多大的濃度？
【cheerfulness】養(yǎng)心肌原代 zui初24h培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1mmol/L的brdu
【gfeng8078】你是怎么樣達到0.1mmol/L的濃度呀，由于有培養(yǎng)液的存在，加了Brdu進去，自然就稀釋了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽濾，可是有報道說這對Brdu的藥效有影響
【jiangbin1230】請問用組織塊貼壁法能培養(yǎng)出腸的成纖維細胞嗎？我試過很多次了，一個皿就只有零散的一二十個成纖維細胞，都是柱狀上皮細胞，是否由于正常組織太少不能培養(yǎng)出??？能幫幫忙嗎？
【sdf771214】請問成纖維細胞的帖壁時間一般是多少?我養(yǎng)的是內(nèi)皮細胞,如何時差帖壁啊?
【victoh】不同來源的成纖維細胞在不同培養(yǎng)支撐介質(zhì)上的貼壁時間應(yīng)該是不一樣的，此外也還受到其他一些因素的影響，至于上皮細胞，其本身種類就更加復雜了
上皮細胞
【warmbull】我現(xiàn)在正在做的培養(yǎng)，但發(fā)現(xiàn)有幾瓶細胞可能是被成纖維細胞（長梭形、透明細胞）污染了，后來成纖維細胞抑制了色素上皮細胞的生長?，F(xiàn)在又出現(xiàn)了這種情況，請問各位大俠，有什么辦法可以除去雜細胞？還有，我養(yǎng)的色素上皮細胞生長增殖很緩慢，有的甚至慢慢萎縮，會是什么原因呢？
【葉知秋】上皮細胞傳代次數(shù)多后，其形態(tài)就類似成纖維細胞，你也可以爬片作細胞鑒定，了解有無污染情況。生長緩慢除提高血清濃度外，還可以增加換液次數(shù)，及時分瓶傳代。
【yhdy2001】你可以試著用高糖培養(yǎng)基，這樣細胞增殖快，目前國外和國內(nèi)較大的細胞研究所普遍采用高糖培養(yǎng)基；另外，做原代時取材很關(guān)鍵，盡量避免筋膜等組織的污染
【pigpig】曾經(jīng)看過一篇論著，具體名字記不清了，里面從分子和蛋白水平論證了視網(wǎng)膜色素上皮細胞傳代4代以后基本沒有RPE原有性質(zhì)特征，只具有成纖維細胞的特征。
【qkk1229】同意N代后就是成纖維細胞的模樣，很多細胞體外培養(yǎng)到后來，都長的象成纖維細胞，不知道為什么，有人知道嗎？
【jamesxia】去除成纖維細胞
1、反復貼壁法（差速貼壁法）：倒去舊培養(yǎng)液，用Hank′s液洗3次，然后加入消化液（0.2%EDTA+0.25%*），37℃10min，鏡下可見成纖維細胞成圓形，癌細胞維持原狀。吸出消化液，加Hank′s液吹打細胞使成纖維細胞脫落，吸出舊液，組織塊和癌細胞團用Hank′s液輕輕漂洗3次。加入培養(yǎng)液CO2孵箱，37℃，每周換液1次，處理1次。
2、血清濃度，上皮細胞耐受低血清環(huán)境的能力較強，而成纖維細胞的耐受力較差，利用這個差異，用含1.5%血清的培養(yǎng)液可以降低培養(yǎng)物中成纖維細胞的生長。
垂體細胞
【ccyy30】我在胚胎大鼠腺垂體細胞的原代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有好多的成纖維細胞和神經(jīng)細胞，如何純化【luoyangu】原代培養(yǎng)中要除去較多的成纖維細胞，在接種細胞于膜插片前，按1～５*１０的５次方個／ml的細胞密度接種到大約5ml 單個細胞懸液到２５立方厘米培養(yǎng)瓶中，原代培養(yǎng)２天后，不經(jīng)*消化，通過吹打收獲漂浮的細胞和被分散的細胞，離心（１５００轉(zhuǎn)／分，１０分鐘），再用培養(yǎng)液將細胞沉淀重新懸浮成細胞懸液，然后接種在膜插片上，這樣可以除去黏附的成纖維細胞而保留要的細胞．
【ccyy30】這種方法是否就是差速貼壁法，膜插片指的是多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板嗎
星形膠質(zhì)細胞
【gaowei98755】 我養(yǎng)過星形膠質(zhì)細胞，我感覺想避免成纖維細胞的污染，需要注意兩方面：1，取材時一定要將腦膜、血管等結(jié)構(gòu)*除去，寧可少留些腦組織，也要將雜質(zhì)（權(quán)且這樣說，即其他結(jié)締組織）去除干凈。2，差速貼壁法，可以將細胞先差速貼壁20~30分鐘，將成纖維細胞去除，然后再將細胞懸液接種到其他瓶中，培養(yǎng)。這兩種方法可以聯(lián)合使用，也可以只用*種方法即可
心肌細胞
【gmwang1991】心肌細胞本來就是不容易貼壁的細胞，在除去心肌細胞中混雜的成纖維細胞和內(nèi)皮細胞就是利用成纖維細胞和內(nèi)皮細胞貼壁快而心肌細胞貼壁慢的原理進行換皿法來純化心肌細胞的。換皿后48小時內(nèi)對你所培養(yǎng)的心肌細胞不進行任何處理，包括觀察，這樣應(yīng)該沒有問題了。如果還是不能夠貼壁的話，你可以考慮一下用塑料瓶，或者對培養(yǎng)用的玻璃瓶進行如下處理：在培養(yǎng)前進行鼠尾膠原包被或者硝酸蝕刻或者纖粘連蛋白包被，在這方面有許多文獻報道的，你只需要注意看都會有解決辦法的。
【貓耳朵】乳鼠心肌細胞培養(yǎng)
盡量除去雜質(zhì)細胞：現(xiàn)在一般的做法是：將消化*的細胞懸液先在大的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1~2小時，然后再小心的吸出仍然懸浮的心肌細胞，再接種到6孔或24孔板上。這樣做主要是盡量除去成纖維細胞。由于成纖維細胞貼壁迅速，而心肌通常在4h后才開始貼壁，這樣才能盡量利用差速貼壁法除去成纖維細胞。
【windboy77】乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞，培養(yǎng)過程較為繁瑣。文獻上有多種濃度*消化方法，我們在試驗中摸索到0.06％濃度的*對細胞損害較小，比起一些文獻記載的0.15％濃度有一定的*性，但這個濃度消化所需時間較長，所以我們又采取多次反復低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細胞。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同, 采用差速貼壁1 h, 除去成纖維細胞，達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，*有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。很好和心肌細胞鑒別。
胰島細胞
【genobody】大鼠胰島細胞原代培養(yǎng)
一周齡Wistar大鼠，斷頸處死，于75%乙醇浸泡15分鐘，無菌取出胰臟，于冰冷無菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔細清除脂肪、包膜、血管等胰外組織，轉(zhuǎn)入*小瓶中，加入少量無菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管輕輕吸出上層細小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D-Hanks液反復清洗8~10次，加入10倍體積無菌消化酶液[*-膠原酶消化液：0.05g*（Sigma），0.025g Ⅴ型膠原酶（Sigma，663U/mg），0.05g葡萄糖，溶于100 mL無Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值為7.4）溶液，用0.22μm微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化，消化過程中不斷震蕩，10分鐘后吸出上面酶液棄去，用無菌D-Hanks液將組織塊清洗2~3次，加入新鮮酶液繼續(xù)消化，重復上述步驟。此時組織塊邊緣模糊，再將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分鐘，將消化酶液與組織塊分開，組織塊重新加入新鮮消化酶液進行消化；而原消化酶液1500rpm離心10分鐘，取沉淀即為消化下的細胞，重新用無菌D-Hanks懸浮，離心，重復1~2次，再用培養(yǎng)基洗2~3次，用培養(yǎng)基懸浮即得細胞懸液；將消化過的組織塊重復消化5~6次至組織塊消化*，重復以上操作，合并幾次所得細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×105個細胞/mL，將細胞懸液接種于24孔塑料培養(yǎng)板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于成纖維細胞貼壁要比胰島細胞迅速，接種15小時后，輕輕振蕩培養(yǎng)板，將上面未貼壁的細胞接入新的培養(yǎng)板中，可除去部分成纖維細胞。將新培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng)48小時后，換新鮮配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5小時，可除去絕大部分成纖維細胞，而胰島細胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2次，并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換培養(yǎng)液，獲得單層胰島細胞，
【wangtsy】胰島的分離與純化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，無菌條件下剖腹取出胰腺置入無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪去除非胰腺組織， 4℃ Hanks液清洗三次后，用眼科剪反復剪切至<0.5mm3組織塊，取濃度為1g/L的V型*5-10ml與之混合,轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，于37℃恒溫水浴振蕩器消化30-40min， 加入兩倍體積4℃Hanks液終止消化，用吸管反復吹吸后過80目 篩網(wǎng)，濾液以800rpm低速離心70s去上清液，并用4℃ Hank's液低速離心清洗2次，除去單個腺泡及上皮細胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640*培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES緩沖液、1mmol/L丙酮酸鈉、100000u/L*G鉀、100mg/L*、71.5umol/L β-巰基乙醇）中制成細胞懸液,接種于75ml玻璃培養(yǎng)瓶中,于37℃,5%CO2,95%空氣條件下培養(yǎng)5h后，用無血清培養(yǎng)基低速離心清洗3次,以除去成纖維細胞。然后用正常*培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)瓶棄去貼壁細胞，用無血清培養(yǎng)液低速離心洗滌兩次，沉淀物即為純化胰島。再用PRMI1640*培養(yǎng)基養(yǎng)吧，可長成胰島單層細胞。
內(nèi)皮細胞
【benn】看到園子里有好多同仁培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞,我也在做內(nèi)皮細胞培養(yǎng),現(xiàn)在看到一種新的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法,正在摸索中,說出來與大家討論.
材料與方法：
材料 :
1.培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、燒瓶、試管，玻璃針等。
2.眼科剪、*、*片。
3.5%CO2孵箱、PH計。
4.恒溫水浴箱。
5.RPMi1640培養(yǎng)基，D-Hank’s緩沖液 、胎牛血清，內(nèi)皮生長因子（ECGF），*，*,戊*鈉等。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠, 大劑量2%戊*鈉麻醉處死，將處死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超凈臺。在無菌狀態(tài)下剪開胸腹腔，分離胸主動脈,用2ｍｌ注射器從主動脈弓處向胸主動脈注入D-Hank’s液,驅(qū)除殘血,取主動脈弓至腎動脈一段，兩端結(jié)扎剪斷，放入60℃預熱無菌水中2秒。然后置于準備好的RPMi1640培養(yǎng)基（含雙抗）中。
2.剪切：在超凈臺上，將血管置于培養(yǎng)皿中,用*小心剝離外膜面的結(jié)締組織,并從根部剪去所有肋間動脈。無血清培養(yǎng)基沖洗數(shù)遍,去除殘血后,將動脈轉(zhuǎn)移至另一含少量培基的無菌培養(yǎng)皿中，用刀片將主動脈兩末端切去,剩下的主動脈切成寬1～1.5ｍｍ的環(huán)。
3.接種：將動脈環(huán)豎直放入35ｍｍ培養(yǎng)皿（1%明膠4℃預置過夜,用前2ｈ移入ＣＯ2培養(yǎng)箱,用前培養(yǎng)液沖洗）中。置ＣＯ2培養(yǎng)箱2ｈ后,加入1.5ｍl培養(yǎng)基。放入37℃,5%ＣＯ2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72ｈ后細胞從環(huán)內(nèi)外生長遷出,環(huán)內(nèi)為內(nèi)皮細胞,環(huán)外為成纖維細胞。將動脈環(huán)除去后,可看到內(nèi)膜面細胞集落與外膜面之間有明顯的無細胞區(qū)界限，用玻璃針剔除成纖維細胞,得到純的內(nèi)皮細胞生長克隆。繼續(xù)培養(yǎng)10～15ｄ，此時FBS濃度為２０％,形成細胞單層。
4.置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔3天換液，培養(yǎng)時添加15% FBS，5～10μg/ml的內(nèi)皮細胞生長因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。待細胞90%~95%融合時，0.25*消化傳代。
5.內(nèi)皮細胞鑒定：相差顯微鏡下,細胞呈單層鋪路石狀;免疫組化證明有vWF相關(guān)抗原存在
6.注意事項:將分離出來的主動脈熱處理時溫度以60℃2秒為宜,太低則成纖維細胞多,太高或時間久則內(nèi)皮細胞遷出減少.
【tomandmikes】如果原代培養(yǎng)后，臍靜脈內(nèi)皮細胞和成纖維細胞并存，如何消除后者？盡管通過消化時間的調(diào)整可以避免成纖維細胞的存在，但是消化時間過短，收集的細胞數(shù)量較少，過長又會增加成纖維細胞污染的機會。
然而一旦污染之后，如何分離純化內(nèi)皮細胞呢？有文獻報道，可以用消化法，根據(jù)消化時間的不同，來篩選內(nèi)皮細胞，我一知半解，還請高手進來指教。
【Goodluck_XD】Simple, fast and efficient mouse endothelial cell isolation with Dynabeads. Isolated cells are pure and free of contaminating fibroblasts
Introduction
Endothelial cells line the entire vascular system, from the heart to the smallest capillary and control the passage of materials and the transit of leucocytes into and out of the bloodstream. Leucocytes interact with endothelial cells during trafficking, immune responses, inflammatory reactions and haemostasis. A pure population of cells, free from contaminating fibroblasts is required to study endothelial cells. Murine tissue is digested to obtain a single cell suspension. Dynabeads coated with an anti-murine endothelial cell antibody are added directly to the cell suspension and the bead-captured cells are separated with a magnet, Dynal MPC.
1.Endothelial cell isolation from murine tissues
A rapid, reproducible method for the isolation of murine tissue endothelial cells （EC） has been developed by Dong et al （1） using Dynabeads M-450 Sheep anti-Rat IgG coupled with a monoclonal rat anti-mouse CD31 antibody. After releasing the beads with trypsin/EDTA, the released cells were centrifuged and resuspended in growth medium for cell culture and further cloning.
Of 300 cells plated, 29 clones were obtained after two weeks and all clones were positive for CD31. To evaluate the specificity and recovery efficiency of this method, the CD31+ murine endothelial cell line H5V was mixed with a melanoma cell line and/or mixed with L929 fibroblasts. In both cases the percentage of isolated cells was > 98% and the recovery was 65% of the original CD31+ murine endothelial cells.
2.Primary mouse lung endothelial cell isolation from cultures
Hartwell et al （2） used lung tissue as plated cells. Dynabeads M-450 Sheep anti-Rat IgG were coated with rat anti-mouse intercellular adhesion molecule-2 IgG and added to the plated cells. After incubation, the cells were trypsinized to release all cells before isolation with the Dynabeads. Endothelial cells were stained for P-selectin, an adhesion receptor for leucocytes.
3.Pure fibroblast and endothelial cell colony cultures from murine bone marrow
The adherent stromal cells of bone marrow consist of endothelial cells, fibroblasts and macrophages. Endothelial cells and macrophages are phagocytic but fibroblasts are not. These differences can be used to isolate the different cell populations. Fei et al （3） used magnetic separation to obtain cultures of EC and fibroblasts （3）. Bone marrow cells were cultured and non-adherent cells poured off. The adherent cells were subsequently used in two ways:
i） To obtain endothelial cells, adherent cells were released from the culture plates with trypsin and Dynabeads M-450 Epoxy were added at the ratio 3 beads to 1 cell and incubated for 2 hours at 37°C. At this temperature, phagocytic cells in culture engulf the beads. The bead-captured cells were collected with the magnet and non-phagocytic fibroblasts discarded. The bead/cell complexes were then cultured in low concentration for 10 days to reduce macrophage growth. Endothelial cell clones （> 20 cells） were then picked and cultured again to confluent growth.
ii） To achieve pure fibroblasts more magnetic beads were used. A 40 bead to 1 cell ratio was added to trypsinized adherent cells to ensure all phagocytic cells （endothelial cells and macrophages） engulf beads. The bead-captured cells were collected and the non-phagocytic fibroblasts were collected and cultured. The fibroblasts were re-passaged to ensure there were no contaminating cells and then grown to confluence.
1.Q. G. Dong, et al., A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues -Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 1997; 17:1599-1604.
2.D. W. Hartwell, et al., Role of P-selectin cytoplasmic domain in granular targeting in vivo and in early inflammatory responses. Journal of Cell Biology 1998; 143 4:1129-1141.
3.R-G. Fei, et al., A method to establish pure fibroblast and endothelial cell colony cultures from murine bone marrow. Exp.Hematol. 1990, 18:953-957.
【zhaoqingshan】Goodluck_XD 斑竹的解決方案可能比較費銀子。
我也曾遇到過類似的問題，一般來說，原代的時候一定要盡可能的純，寧可錯殺一千，不可放過一個成纖維細胞，否則傳代后細胞就會比較雜。所以原代不夠純就放棄。另外，給足生長因子讓內(nèi)皮充分的生長起來。
以前一個老師提供過采用膠原酶的方法，差速消化，不知道是否有效，樓主可以試試，有結(jié)果告訴我。另外，有些差速貼壁的方法，好像并不合適，因為內(nèi)皮貼壁也很快的。
我也是聽說的，并不可靠啊，您試驗一下，就是用0.1%I型或II型膠原酶消化，試試，據(jù)說成纖維細胞會先掉下來。要是有結(jié)果，一定要告訴我??！呵呵！
說實話，我養(yǎng)過好幾種內(nèi)皮，就是沒有正兒八經(jīng)的養(yǎng)過HUVEC，幫別人養(yǎng)過幾次，純度還可以（其實消化得好的話，不存在雜細胞的問題的，傳2-3代進行實驗沒有問題的），就是傳不了幾代。
【tomandmikes】是啊，純度的問題好說，可以摸索控制時間，但是要不加生長因子等刺激物，僅用培養(yǎng)基和血清，很難多次傳代。其實消化后的成纖維細胞不是很多，但見了很煩，我且試試你說的方法。不知道用*可以不可以？
【zhaoqingshan】應(yīng)該是不可以的，我試過，換低濃度的*也不可以的。內(nèi)皮和成纖維被消化下來的時間差不多。用ECGF 20ug/ml也不是很貴的，我倒覺得胎牛太貴了。因為我以前養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮用ECGF 150ug/ml。
混合星形細胞
【midas】混合星形細胞的培養(yǎng)
1、取材:取新生4天SD大鼠，頸動脈放血，無菌操作取出 腦組織，切除腦干和海馬，解剖顯微鏡下仔細剔除腦膜和血管等結(jié) 締組織。
2、機械分散:取大腦皮質(zhì)轉(zhuǎn)移至試管中，并將其快速剪成 1 mm3 左右小塊，加適量培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，使細胞分散，制成細 胞懸液，再經(jīng)74 um網(wǎng)篩過濾，取濾液，離心，1500r/min, Smin, 重懸細胞，進行細胞計數(shù)。
3、細胞計數(shù):臺盼藍:細胞懸液=1: 9染色，在顯微鏡下計 數(shù)。
4、接種與培養(yǎng):調(diào)整細胞密度，以1 X 105/cm`的密度接種于 預先涂有多聚賴氨酸（poly-L-lysine, PLL）的培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng) 箱中孵育30min,翻轉(zhuǎn)瓶并吸出細胞懸液再接種于培養(yǎng)瓶中，以除去成纖維細胞。370C, 5% C0.2培養(yǎng)，每3天換液一次，培養(yǎng)10天。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)細胞，見細胞分為兩層:下層是 TIA，上層是0-2A祖細胞。
人胚嗅鞘細胞
【lvranbo1010】 人胚嗅鞘細胞的原代培養(yǎng)
將胚胎頭部剪下，浸泡在75％的酒精內(nèi)3分鐘，大量D-Hanks*沖洗。*下，超凈臺內(nèi)，迅速完整取出兩側(cè)嗅球,置于4℃的D-Hanks*中，小心除去軟腦膜,血管及與其相連的組織。然后用顯微器械剪取嗅球zui外兩層（嗅神經(jīng)層和小球?qū)?ONGL）,再用D-Hanks*洗3遍。置于含3－4ml DMEM/F12培養(yǎng)基的35mm2培養(yǎng)皿內(nèi)，將剪取的ONGL組織塊用顯微器械小心撕開，再用火焰拋光后的移液管小心反復吹打至盡可能?。ㄎ鹗古囵B(yǎng)基產(chǎn)生過多的氣泡），放入CO2培養(yǎng)箱（5%CO2,37℃）中培養(yǎng)。
人胚嗅鞘細胞的純化
取材于人胚嗅球的嗅鞘細胞在培養(yǎng)過程中有多種其他細胞，如來自血管、軟腦膜等結(jié)締組織的成纖維細胞,以及神經(jīng)元、星狀膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等。其中，成纖維細胞是嗅鞘細胞培養(yǎng)體系中zui棘手的污染細胞,其分裂增殖和貼壁速度極快,遠遠超出嗅鞘細胞的分裂增殖和貼壁速度,且侵蝕面積大。這個特點與動物相似。用于動物嗅鞘細胞純化的方法很多，有差速貼壁、化學藥物法、梯度離心法、免疫親和吸附法等。目前國內(nèi)外大多采用阿糖胞苷來達到純化的目的。但我們參考動物嗅鞘細胞的純化方法，在不同時間加入1×10－6－1×10－9濃度的阿糖胞苷，每數(shù)量級分別培養(yǎng)10次。我們發(fā)現(xiàn)，與動物嗅鞘細胞培養(yǎng)過程中阿糖胞苷純化效果較好相比，人胚的嗅鞘細胞用阿糖胞苷純化效果極不理想，且嗅鞘細胞數(shù)目大大減少。故試驗中，我們放棄了阿糖胞苷純化的方法，而采用了差速貼壁＋免疫親和吸附的純化方法。根據(jù)胎齡的不同，把含有嗅鞘細胞的培養(yǎng)基在CO2培養(yǎng)箱（5%CO2,37℃）中培養(yǎng)12－24小時。培養(yǎng)過程中，每2小時相差顯微鏡下觀察一次。如觀察到較多的立體感較強的細胞開始貼壁時，立刻將含有未貼壁的細胞的培養(yǎng)基接種到預先用Ｐ75抗體包被的35mm2培養(yǎng)皿內(nèi)，放入CO2培養(yǎng)箱（5%CO2,37℃）中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)36－48小時換液, 祛除未能和Ｐ75 抗體結(jié)合的細胞。
人胚嗅鞘細胞的免疫細胞化學染色及免疫熒光染色及嗅鞘細胞純度檢測
用于嗅鞘細胞免疫染色的抗體較多[1]，有膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），p75 NTR等，因本培養(yǎng)皿預先用p75抗體包被，故選用GFAP（1：1500）抗體進行免疫染色。成纖維細胞不能為GFAP抗體所標記，而嗅鞘細胞對GFAP標記較敏感且染色均一。所以GFAP免疫組化法可用于鑒別嗅鞘細胞和成纖維細胞。GFAP免疫組化法的缺點是不能區(qū)別OECs與其他中樞神經(jīng)膠質(zhì)細胞如小膠質(zhì)細胞等,但前者從形態(tài)上（嗅鞘細胞的細胞有一個甚至多個突起，且突起十分細長）很容易與這些細胞區(qū)別出來。將培養(yǎng)好的嗅鞘細胞繼續(xù)培養(yǎng)13d,分別在培養(yǎng)1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d棄掉上清,用0 .01MPBS清洗3次,接著用4%多聚甲醛固定30分鐘,再用PBS清洗3次,0.3％雙氧水處理10min,0.01MPBS清洗3次， Triton x-100洗30分鐘，0.01MPBS清洗3次。滴加正常山羊的血清封閉液封閉20分鐘后，甩去多余液體，不洗，加膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）羊抗血清,按ABC法進行免疫細胞化染色,同時進行免疫熒光染色，并設(shè)立空白對照和替代對照。將染色的細胞分別置于OLYMPUS倒置相差顯微鏡和OLYMPUS熒光顯微鏡觀察, 計數(shù)嗅鞘細胞的百分率。
免疫組織化學反應(yīng)顯示：帶細長突起的單極、雙極或多極的梭形細胞抗－GFAP，抗－nestin均陽性，可以確定這些細胞為嗅鞘細胞。成纖維細胞為GFAP反應(yīng)陰性,神經(jīng)元也呈GFAP陰性反應(yīng)。雖然星狀膠質(zhì)細胞也為GFAP反應(yīng)陽性,但從形態(tài)上容易區(qū)分兩種膠質(zhì)細胞（見圖E－F）。
在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，需要大量的純度較高的嗅鞘細胞，這是移植是否成功的基礎(chǔ)。我們認為，由于成纖維細胞的生長速度大大快于嗅鞘細胞，所以，通過差速貼壁的方法，可以祛除大部分的成纖維細胞，而免疫吸附可以使絕大部分的嗅鞘細胞貼壁，免疫吸附后培養(yǎng)36－48小時換液,能祛除未能和Ｐ75結(jié)合的其他細胞。如：神經(jīng)元、星狀膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞。此時獲得的嗅鞘細胞是純度比較高的。雖然近期文獻報道[2]，一定數(shù)量的其它細胞，可促進嗅鞘細胞的作用。但這尚需進一步的研究。
在動物嗅鞘細胞培養(yǎng)的實驗中，國內(nèi)及大部分國外實驗室都通過加入阿糖胞苷來達到祛除成纖維細胞的目的。但我們實驗室通過分析不同時間點加入1×10－6－1×10－9濃度的阿糖胞苷培養(yǎng)結(jié)果，我們認為加入阿糖胞苷雖然可在短期內(nèi)有效抑制成纖維細胞生長，但同時也抑制了嗅鞘細胞的生長，且在撤除阿糖胞苷很長時間后，嗅鞘細胞仍不能明顯增殖。同時有可能殘存的成纖維細胞由于失去了嗅鞘細胞高密度抑制從而迅速增生，使嗅鞘細胞純度迅速下降。
p75是神經(jīng)營養(yǎng)因子低親和力受體,在嗅鞘細胞膜表面由跨膜、細胞外和胞質(zhì)等三部分組成,其抗體能和細胞外部分發(fā)生特異性結(jié)合。因此,包被在培養(yǎng)皿上的p75抗體可以通過抗原抗體反應(yīng),在較短時間內(nèi)將表達p75的嗅鞘細胞吸附在培養(yǎng)皿表面。而其它污染細胞由于缺乏p75，所以貼壁較慢。
人胚的嗅鞘細胞接種后，胎齡越小，貼壁所需時間越短。在有無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，形態(tài)無明顯差異。人胚的嗅鞘細胞較動物嗅鞘細胞生長快，且體積與突起長度均較動物的嗅鞘細胞大。因此，我們可以認為不同種屬的嗅鞘細胞是有差異的。雖然表達有同樣的物質(zhì)，但也可能表達不同的物質(zhì)。所有這些需要進一步研究。這對于zui終的臨床應(yīng)用有著重大意義。
間充質(zhì)干細胞
【flyingpumc】兔骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法
兔骨髓間充質(zhì)干細胞的提取、分離:取日本大耳兔10 只,4 個月齡,體重215～310kg。用2 %*于手術(shù)部位施以局部麻醉,在無菌操作下以骨髓穿刺針刺入兔髂骨骨髓腔,接5ml注射器,內(nèi)含3000U/ ml 的肝素0.2ml ,抽出骨髓4～6ml ,經(jīng)低糖的DMEM 稀釋后,與Percoll 液（ Pharmacia ,比重1.073g/ ml） 按1∶1 的比例進行梯度離心,928g 離心20min。離心后緩慢吸取中間交界面乳白色云霧狀懸浮細胞至另一試管,以低糖的DMEM 洗滌兩次,懸浮。
將上述分離所得單核骨髓細胞按2.0 ×105/ cm2接種于含有10 %胎牛血清（FBS） 的HG2DMEM（含有*100μg/ ml 、*100μg/ ml ,pH7.2） 的聚苯乙烯一次性培養(yǎng)瓶內(nèi),于37 ℃,5 %CO2 ,100 %飽和濕度條件下進行細胞箱培養(yǎng)。于72h 后除去非貼壁細胞,同時更換新鮮的培養(yǎng)液,以后每隔1 天更換新鮮的培養(yǎng)液,用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及其生長變化并攝像,待細胞生長鋪滿至瓶底約90 %以上融合時,用0.25 %*和0.01 %EDTA 消化貼壁細胞,取原代MSCs 進行相關(guān)的檢測,同時按同樣的密度進行傳代。
兔骨髓間充質(zhì)干細胞的傳達培養(yǎng):將傳代的第P1 代、第P4 代、第P8 代間充質(zhì)干細胞,按每孔2 ×105個定量接種于24 孔培養(yǎng)板,次日起,每天取3 孔的細胞,經(jīng)0.25 %*消化后,作細胞計數(shù),直至基本鋪滿整個瓶底。按3 孔細胞均數(shù)取點,繪制其生長曲線。傳代培養(yǎng)過程中,隔日換液。
實驗研究用Percoll （密度為1.073g/ ml） 梯度離心法加貼壁培養(yǎng)方法提取MSCs 既是簡便的,又是實用的,與Ficoll （密度為1.077g/ ml） 梯度離心法相比,其比重較輕,能夠在梯度離心時利用MSCs 與成纖維細胞比重不同,將MSCs 與成纖維細胞分離開;單層貼壁培養(yǎng)法又將不能貼壁的造血細胞分離開。
肝細胞
【yangqingdoctor】從胎鼠肝中獲得的細胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)成纖維細胞特別多，而肝細胞較少，請問有什么辦法可以很好的去除成纖維細胞，percoll離心可以嗎，具體怎樣？
細胞傳代時，用*消化,細胞變化不大,還是貼壁,請問為什么,怎樣處理?
【huangxianzi】
1、試試看肝細胞培養(yǎng)基，如Gibco的Hepato－ZYME,可有效去除雜細胞。
2、還可試試梯度貼壁法，因成纖維細胞貼壁比肝細胞快，因此培養(yǎng)1小時后，換瓶，再重復一次，看看有無效果，但操作過程中，注意溫柔一些，因肝細胞在體外很難培養(yǎng)。
liubo4210482sin培養(yǎng)平滑肌細胞中,出現(xiàn)了很多的成纖維細胞,請問有什么好的辦法可以分離出它們???
有人說.用*消化以后,兩種細胞貼壁有快慢:成纖維細胞貼壁快,平滑肌細胞貼壁慢,靠掌握時間將它們分離開.
上面的說法是否正確,那么消化后,（細胞貼壁過程中）該在多少小時以后將懸浮液轉(zhuǎn)移,另外培養(yǎng),才能得到比較純的平滑肌細胞???
shawm
多準備幾個培養(yǎng)皿，消化重懸后，你隨時觀察細胞，過一段時間取上清，轉(zhuǎn)入另一個培養(yǎng)皿。可以反復多次轉(zhuǎn)皿。你的平滑肌細胞在上清中，所以可以時間稍長一點，但別等到大部分細胞貼壁。
chaoyuan
1、差速貼壁法。成纖維細胞貼壁快,平滑肌細胞貼壁慢。
2、加入5-溴-2′-脫氧尿苷（5-Brdu）,終濃度為0.1 mM ，抑制成纖維細胞生長。