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動(dòng)物淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分離
最近更新時(shí)間：2012-11-20
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動(dòng)物淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分離
基本方案1：灌注消化法
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 哺乳動(dòng)物胸導(dǎo)管淋巴管
2. 1×PBS，含*100u/ml和*100μg/ml，pH7.4
3. 0.2%Ⅰ型膠原酶
4. 眼科剪，*
5. 慕絲線（7號(hào)線）、細(xì)鐵絲
6. 離心管（15ml、50ml）
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 處死動(dòng)物后，打開胸腔，分離胸導(dǎo)管，在胸導(dǎo)管上端結(jié)扎，切取10-15cm的一段。將胸導(dǎo)管放入預(yù)冷PBS中漂洗。
2. 在解剖顯微鏡下，用眼科剪和*剝除外膜的脂肪和纖維組織，然后用PBS反復(fù)沖洗管腔。
3. 將胸導(dǎo)管移入含PBS的大培養(yǎng)皿中，清洗3次。在胸導(dǎo)管的遠(yuǎn)端插入*，并結(jié)扎固定。用PBS沖洗管腔后，將游離端結(jié)扎。用*向管腔內(nèi)注入消化液，至淋巴管充盈為止。在37℃條件下，消化10min。淋巴管的管壁較薄，灌注消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免消化過(guò)度，引起成纖維細(xì)胞的污染。
4. 取出胸導(dǎo)管，在游離端剪一小口，用離心管收集消化液，然后用培養(yǎng)液沖洗管腔，收集消化液和沖洗液，以1000r/min，離心10min。離心后吸去上清液，用培養(yǎng)液輕輕混懸細(xì)胞。
5. 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后補(bǔ)充培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2-3d換液1次。換液時(shí)，吸去1/2-2/3培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液。
6. 原代培養(yǎng)4-6h后，大部分細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)。24h后，內(nèi)皮細(xì)胞形成由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞群。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的活性較低，原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。2-3周后，細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層。淋巴管內(nèi)皮單層呈卵石狀特征性排列，可傳代培養(yǎng)。
基本方案2：植塊培養(yǎng)法
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 哺乳動(dòng)物胸導(dǎo)管或腸系膜淋巴管
2. 1%明膠鋪底，置超凈臺(tái)晾干
3. 1×PBS，含*100u/ml和*100μg/ml，pH7.4
4. 眼科剪，*
5. 慕絲線（7號(hào)線）、細(xì)鐵絲
6. 離心管（15ml、50ml）
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 處死動(dòng)物后，打開胸腔，分離胸導(dǎo)管，在胸導(dǎo)管上端結(jié)扎，切取10-15cm的一段。將胸導(dǎo)管放入預(yù)冷PBS中漂洗。
2. 在解剖顯微鏡下，用眼科剪和*剝除外膜的脂肪和纖維組織，然后用PBS反復(fù)沖洗3次。用*縱向切開管腔，再用PBS沖洗管腔面。然后，將管腔剪成約1mm3 的小塊。
3. 將組織快放入培養(yǎng)皿中，使內(nèi)膜面朝下，放入37℃，含5%CO2 的孵箱中培養(yǎng)4h。加入培養(yǎng)液，胸導(dǎo)管組織塊能否貼壁是內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。因此，加入培養(yǎng)液時(shí)操作要輕，以免使組織塊浮起。
4. 靜置培養(yǎng)3d后換液，以后每隔2-3d換液1次。培養(yǎng)4-6d后，內(nèi)皮細(xì)胞開始自植塊長(zhǎng)出，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形。2-3周后，細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層。待細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層時(shí)，可傳代培養(yǎng)。