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PCR產(chǎn)物的直接測序
最近更新時間：2012-11-21
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詳細介紹：
PCR產(chǎn)物的直接測序
1.凝膠純化PCR擴增的靶序列
如果*PCR反應(yīng)條件不能產(chǎn)生所需的特異性產(chǎn)物，可采用新的寡核苷酸重新進行擴增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產(chǎn)物，而后再各自重新擴增進行序列分析。長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:
1.片段大小在80-100bp時，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來分離。
2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復(fù)凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴散出來。
4.取少量（1-5%）進行第二次擴增，為得到純凈單一的產(chǎn)物，用于第二次PCR擴增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng。
5.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質(zhì)。因而，如需重新擴增供Tab聚合 酶測序用的片段，用丙烯酰胺電泳分離。
當用PCR引物擴增幾個同樣長度的相關(guān)序列時，如來自幾個新近復(fù)制的基因，或重復(fù)序列或保守的信號序列（conserved signal sequences）的同樣顯子，可以通過下列兩種不同方法來改進電泳分離。
1）.先用只切割某一模板的內(nèi)切酶進行酶切，而后電泳純化完整的PCR產(chǎn)物。
2）.用可使核苷酸序列不同的擴增產(chǎn)物分開的電泳系統(tǒng)。下一個部份將討論此類系統(tǒng)中的變性甲酰胺梯度凝膠系統(tǒng)。采用方法一時，必須事先了解在不同PCR產(chǎn)物中的內(nèi)切酶位點。
2.雜合體的直接測序
當兩個等位基因由于單一位點突變而產(chǎn)生差異時，用一個PCR引物直接進行測序，能找出雜合位點。但是，帶有幾個點突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測序，將產(chǎn)生復(fù)合序列帶（compound sequencing ladders）。
當兩個等位基因由于單一位點突變而產(chǎn)生差異時，用一個PCR引物直接進行測序，能找出雜合位點。但是，帶有幾個點突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測序，將產(chǎn)生復(fù)合序列帶（compound sequencing ladders）。
有四種方法可以確定幾種點突在型并從雜合體中獲得單個等位基因的序列:
1）.克隆分離不同 的模板
2）.在測序之前，利用模板之間核苷酸序列的差異，用電泳技術(shù)分離不同的模板
3）.在測序反應(yīng)中只啟動一個等位基因
4）.只擴增一個等位基因
3.測序模板的制備
與PCR產(chǎn)物的直接測序有關(guān)的一些問題是變性后由于擴增片段的兩條鏈可以迅速結(jié)合起來，從而阻止了測序引物與它的互補序列退火，或阻止了引物──模板復(fù)合物的延伸。在測序反應(yīng)中，模板鏈重新結(jié)合使一小部份模析驂與測序從而弱化zui終的測序條帶。為減少此問題，可用改進的標準雙鏈DNA測序法或用PCR制備單鏈模板。
.雙鏈DNA模板
.雙鏈DNA模板
有兩種不同方法用來制備測序用的模板，目前都已用來測定共價閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒模板的序列。用這些方法來進行PCR產(chǎn)物的測序通常是較困騅的，因為短的線性模板比團環(huán)質(zhì)粒的雙鏈更易于重新結(jié)合。在這兩種方法中，PCR片段可以由凝膠電膠或在電泳前*行旋轉(zhuǎn)透析（Spin-dialysis）純化。
1.在室溫下，模板先在0.2M NaOH中變性5分鐘，冰凍，加入0.4倍的5M醋酸銨 （pH7.5）來中和反應(yīng)。立即用四體積的無水乙醇沉淀DNA。在合適的退火溫度下，加入測序緩沖引物。
2.在95℃下保溫5分鐘來變性模板，冰浴（或在干冰乙醇中）快速冷卻離心管，以減少鏈的重新結(jié)合。加入測序引物并使反應(yīng)達到合適的溫度。測序引物在變性前或后加入都合適。
單鏈DNA模板
單鏈DNA模板
使用單鏈模板可以避免測序中鏈的重新結(jié)合。單鏈模板可以從雙鏈DNA模板經(jīng)鏈分離凝膠中制備，或用PCR反應(yīng)制備。大于500bp的單鏈DNA片段，可從瓊脂糖凝膠中分離笪到，但它不適合于更短的單鏈。制備單鏈DNA的另一種不同方法是在PCR反應(yīng)中使用一個*標記的引物，變性后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過一個親合素柱而使兩條鏈得到分離，只有*標記的鏈才可結(jié)合到柱上。
然而，zui簡單的方法是用改進的PCR方法，用此方法制備既定的單鏈DNA。在這個反應(yīng)中（不對稱PCR，asymmetric PCR），在開始的20-25個循環(huán)中，兩個比率不對稱的擴增引物產(chǎn)生出雙鏈DNA，當*的那個引物耗光后，隨后的5-10個循環(huán)就產(chǎn)生出ssDNA。單鏈DNA在約在25個循環(huán)后開始出現(xiàn)，這時*的引物也幾乎耗盡。經(jīng)過一個短暫快速上升后，ssDNA就開始如預(yù)期的那樣呈線性積累，這時反應(yīng)中僅有一個引物存在。各種比率的引物都以這種形式產(chǎn)生 ssDNA。一般對100μlPCR反應(yīng)體系而言，引物比率為50pmo:0.5pmol，經(jīng)過30個循環(huán)后，大約可產(chǎn)生1-3pmol的ssDNA。
ssDNA的產(chǎn)量可用下列幾種方法來估計:a）。在PCR 反應(yīng)中，除了加入正常數(shù)量的dDNA外，還加入32P-dNTP。取10%的反應(yīng)產(chǎn)物在薄的3% NuSieve+1%普通瓊脂糖凝膠中電泳，干燥并與膠片一起曝光。b）.取5%的反應(yīng)物來走 膠，轉(zhuǎn)移到膜上，并用與ssDNA互補的寡核苷酸為探針雜交。ssDNA不能用EB染色來定 量，因為ssDNA有形成二級結(jié)構(gòu)的趨勢且染料的插入在模板中是隨機的。使用不對稱引物比例的擴增效率比兩種引物均過量80-90%）的擴增效率低（70%）。
在實驗中，這可通過增加PCR循環(huán)的次數(shù)來彌補。若不對稱的PCR反應(yīng)不能產(chǎn)生足夠數(shù)量的ssDNA，可以試一試不同的引物比率;b）.再加5-10個PCR循環(huán);c）.在zui后五個循環(huán)中多加Tab聚合酶（2U）;d）.試一下相反的不對稱引物比率。有時，相反的不對稱引物比率可能給出不同產(chǎn)量的ssDNA。制備出的單鏈DNA用*的那個PCR引物或用一個內(nèi)引物來測序，并應(yīng)用常規(guī)方法進行摻入測序（incorporation sequencing）或標記引物測序。制備出的 ssDNA鏈可能有一個不連續(xù)的5-末端，但可能在靠近3-末端不同位點處被切去，這是由于延伸過程中終止過早所產(chǎn)生的。然而，對于測序反應(yīng)中所使用的任何一種引物，只有完整的ssDNA可以用作測序模板。
zui近還報道了另一種方法制備單鏈核酸模板進行直接測序。這種方法包括在一個 PCR引物上加入噬菌體的啟動子，轉(zhuǎn)錄出該PCR產(chǎn)物的RNA拷貝，再用反轉(zhuǎn)錄酶不測序。但由于擴增反應(yīng)后附加了一個酶促反應(yīng)步驟和限于用反轉(zhuǎn)錄酶作為測序酶，這種方法的應(yīng)用受到很大的限制。
4.用不耐熱DNA聚合酶進行PCR產(chǎn)物的測序
4.用不耐熱DNA聚合酶進行PCR產(chǎn)物的測序
一些不耐熱DNA聚合酶已經(jīng)用來直接測序體外擴增的DNA。使用Klenow聚合酶，修飾T7DNA聚合酶（測序酶）及反轉(zhuǎn)錄酶來測序。
用Taq聚合酶進行PCR產(chǎn)物的測序