兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 成纖維細(xì)胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以?xún)?nèi)狀態(tài)

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干分離自股骨、脛骨；骨內(nèi)膜是一層致密結(jié)締組織膜，覆蓋在骨的表面（關(guān)節(jié)面除外），新鮮骨內(nèi)膜呈粉紅色，含有豐富的血管、神經(jīng)和成骨細(xì)胞。此外，附著于骨的肌腱、韌帶于附著部位都與骨內(nèi)膜編織在一起。因而骨內(nèi)膜與骨質(zhì)結(jié)合甚為牢固。骨內(nèi)膜富含血管、神經(jīng)，通過(guò)骨質(zhì)的滋養(yǎng)孔分布于骨質(zhì)和骨髓。骨內(nèi)膜分內(nèi)、外兩層，外層主要是粗大的膠原纖維束，部分纖維穿入骨質(zhì)，使骨內(nèi)膜固定于骨面；內(nèi)層疏松，含成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞（分別具有產(chǎn)生新骨質(zhì)和改建骨的功能）。骨髓腔和骨松質(zhì)的網(wǎng)眼也襯著一層菲薄的結(jié)締組織膜，叫做骨膜。骨內(nèi)膜的內(nèi)層和骨膜有分化成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的能力，以形成新骨質(zhì)和破壞、改造已生成的骨質(zhì)，所以對(duì)骨的發(fā)生、生長(zhǎng)、修復(fù)等具有重要意義。骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、神經(jīng)等多種組織分化，因此可以作為組織工程中的種子細(xì)胞。骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件要求較高，在培養(yǎng)過(guò)程中，受貼壁時(shí)間、種植密度、血清含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值等條件的影響。
方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干采用沖洗骨髓、消化骨內(nèi)膜、差速貼壁法結(jié)合培養(yǎng)基篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干經(jīng)CD90免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

一、細(xì)胞培養(yǎng)

1取材 在無(wú)菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過(guò)一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過(guò)程稱(chēng)為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無(wú)取材這一過(guò)程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。2培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過(guò)程稱(chēng)為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無(wú)限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

二、原代細(xì)胞分離

凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱(chēng)之為原代細(xì)胞。1懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。2實(shí)體組織材料的分離方法對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。

三、細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)

目前主要有兩種用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過(guò)直接測(cè)定進(jìn)行分裂

的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細(xì)胞活力（cell viability）檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。顯然，細(xì)胞活力檢測(cè)法并不能最終證明檢測(cè)樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會(huì)自發(fā)啟動(dòng)凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時(shí)若采用細(xì)胞活力檢測(cè)法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細(xì)胞數(shù)大于對(duì)照組的事實(shí)說(shuō)明藥物可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以最直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

取材：首先，用培養(yǎng)液濕潤(rùn)所取的組織材料，并用鋒利的眼科剪去除附在其上的脂肪和結(jié)締組織。接著用平衡液（如PBS或Hanks液）漂洗，再用眼科彎剪將組織塊剪成小塊。多次用PBS或Hanks液漂洗，直到液體清亮、無(wú)油滴為止。

接種：用濕潤(rùn)的吸管吸取切碎的組織塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶皿中，并按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上。注意不要過(guò)多，確保組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上。

培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側(cè)的對(duì)側(cè)面加足培養(yǎng)液，避免組織塊與培養(yǎng)液接觸，然后塞緊瓶塞。將種植了組織塊的一側(cè)朝上，靜置于37℃培養(yǎng)箱中。待組織塊貼壁1到3小時(shí)后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒(méi)在培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置。換液：每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時(shí)間。

一、原代細(xì)胞計(jì)數(shù)

將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。

將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿(mǎn)蓋片和計(jì)數(shù)板之間。

靜置3分鐘。

鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000

注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

二、原代細(xì)胞活力

將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。

加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘。

吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。

死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見(jiàn)深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀。

活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來(lái)進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。