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羊抗人血清抗體

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更新時(shí)間:2021-12-28 17:07:42瀏覽次數(shù):885次

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羊抗人血清抗體*,羊抗人血清抗體用于免疫組化實(shí)驗(yàn),WB實(shí)驗(yàn),相應(yīng)的標(biāo)記抗體有HRP標(biāo)記抗體,F(xiàn)ITC標(biāo)記,BIO等。

【貯存條件】: 貯存于-20℃. 本品應(yīng)在低溫下保存,長時(shí)間在暴露在空氣中,含量會(huì)有所降低。

規(guī)格:0.5ml

材料和方法

  . 材料 人成骨肉瘤MG63細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。重組質(zhì)粒MycSSHL(WT)、MycSSHL(S937A S978A/2SA)以及recombinant cofilinHis6由王巖教授惠贈(zèng)。脂質(zhì)體 2000( Invitrogen公司)。高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco 公司),胎牛血清(Hyclone公司),*和EDTA(Sigma 公司)。A2387,KN93,CaM,重組Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain,Calbiochem)。抗體:Myc (9E0;Roche),HA (3F0;Roche),Pcofilin,Cofilin(Santa Cruz), CaMKⅡδδ4 (Trans Genic Inc.),PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒(邁晨科技有限公司)。

  .2 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) MG63細(xì)胞鋪于35 mmol/L培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞密度達(dá)到60%~70%時(shí),轉(zhuǎn)染MycSSHL,48 h后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h,分別加入濃度為0.5,,2.5,5 μmol/L的A2387孵育0 min后裂解細(xì)胞,離心取上清加入凝膠加樣緩沖液,沸水浴上加熱5 min,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交〔一抗分別為Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及CaMK Ⅱ δ(4)〕、ECL顯色。

  .3 體外激酶測(cè)定 MycSSHL(WT)及其突變體MycSSHL(2 SA)分別轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞,48 h后采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體,對(duì)照組為抗IgG抗體。回收MycSSHL,加入0.6 μg/ml重組活性CaMKⅡ(單獨(dú)或同時(shí)加入抑制劑KN93)以及00 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 于 20 μl 激酶反應(yīng)緩沖液中,30℃反應(yīng)40 min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,應(yīng)用放射自顯影技術(shù)檢測(cè)32P 標(biāo)記的SSHL水平。

  .4 體外SSHL磷酸酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn) MycSSHL(WT)或MycSSHL (2 SA)轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞,48 h后,采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體,對(duì)照組為抗IgG抗體?;厥誐ycSSHL,加入0.6 μg/ml CaMKⅡ(單獨(dú)或同時(shí)加入抑制劑KN93),20 μg/ml CaM,以及 6.3 μg/ml cofilinHis6 于 20 μl 反應(yīng)緩沖液(50 mol/L HEPES,pH 7.4,0. mol/L CaCl2,0.5 mol/L EDTA,3 mol/L MgCl2,00 mmol/L NaCl, mol/L dithiothreitol,0.5 mg/ml BSA, μg/ml leupeptin),中30℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交(一抗分別為Pcofilin,Cofilin, cmyc 抗體)、ECL顯色。

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