SPA夾心ELISA試驗檢測CIC

【資料簡介】

金葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可與IC中IgG的Fc段結(jié)合。將待測血清用低濃度PEG沉淀后加至SPA包被的固相載體上，再以酶標記的SPA與之反應(yīng)，即可檢測樣本中有無IC。
（一）試劑
1．5％與2．5％PEG用0．02mol/LpH7．4PBS配制。
2．牛血清白蛋白（BSA）緩沖液：用0．05mol/L pH 7．4PBS配制。含0．01mol/L EDTA、0．1％硫柳汞，0．05％Tween 20，4％BSA。
3．HRP—SPA用改良過碘酸鈉法將SPA與辣根過氧化物酶（HRP）制成結(jié)合物。zui適工作濃度以方陣法滴定。
4．熱聚合人IgG：人IgG 10mg/mL，63℃加熱20min制成。
（二）操作步驟
1．用PBS稀釋SPA成5Ps/mL，包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔，每孔0．1mL（對照孔不包被），置4℃過夜后洗滌3次備用。
2．待測血清0．05mL加PBS0．15mL和5％PEG0．2mL混勻，4℃過夜后1 600r/min離心20min，棄上清，沉淀用2．5％PEG洗2次，加入PBS0．2mL和BSA緩沖液0。2mL，混勻，置37℃水浴30min，搖動，使*溶解。
3．將已溶解的待測血清沉淀物加至上述包被孔和對照孔中，置37℃ 60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H202）0．1mL，37C 20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴終止反應(yīng)。置酶標儀492nm測各孔吸光值。
4．標準曲線制備 取正常人血清0．2mL，加熱聚合人IsC（120ug/mL）0．2mL，再加PBS0．4mL和5％PEG0．8mL，置4℃過夜。同時做不加熱聚合人耽的正常血清對照，以排除血清中干擾因素。沉淀清洗同標本操作。用稀釋的BSA緩沖液（加等量0．01 mol/LpH7．4PBS）1．6mL溶解并稀釋成120、60、30、15、7．5ug/mL，與待測血清同法操作，制成工作標準曲線。
5．結(jié)果判斷 從待測血清吸光度值查標準曲線，即可換算成相當于熱聚合人IgG的CIC含量（ug/ml）。以高于正常對照X+2S，即大于28．4ug/mL為陽性。
（三）注意事項
1．熱聚合人IgC應(yīng)分裝貯存于—20℃，不宜反復(fù)凍融，否則易解聚。
2．PEG的濃度影響CIC沉淀量，須嚴格配制。