脂肪酸合成酶（FAS）活性試劑盒

【資料簡介】

測定意義：

FAS是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸。FAS普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。

測定原理：

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長鏈脂肪酸和NADP⁺；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP⁺沒有；通過測定340nm 光吸收下降速率，計(jì)算FAS活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解凍后混勻。

試劑二：粉劑×1瓶。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解。

試劑四：液體×1瓶, 4℃保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入840μL試劑四，充分溶解。

粗酶液提取：

稱取約0.1g樣品，加試劑一1 mL充分研磨，16000rpm 4℃離心40min，取上清液，待測。

FAS測定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑四置于40℃水浴中預(yù)熱30 min以上。

3. 空白管：在500μL EP管中依次加入20μL蒸餾水、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五，迅速混勻后于340nm處測定吸光值，記錄第30s和90s時(shí)吸光值，分別記錄為A1和A2。△A空=A1-A2。

4. 測定管：在500μL EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五，迅速混勻后于340nm處測定吸光值，記錄第30s和90s時(shí)吸光值，分別記錄為A1和A2。△A測=A3-A4。

FAS活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADPH 為1U。

FAS(U/mg prot) =[(△A測定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶] ÷(Cpr×V樣)÷T

=1.61×(△A測定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADPH 為1U。

FAS(U/g 鮮重)= [(△A測定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

               =1.61×(△A測定管–△A空白管) ÷W          

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

 

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADPH 為1U。

FAS(U/mg prot) =[(△A測定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶] ÷(Cpr×V樣)÷T

=3.22×(△A測定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADPH 為1U。

FAS(U/g 鮮重)= [(△A測定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

               =3.22×(△A測定管–△A空白管) ÷W   

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

注意事項(xiàng)：

上清液蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。