士鋒生物關(guān)于如何轉(zhuǎn)基因小鼠報告的詳細介紹

【資料簡介】

 在研發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠或基因嵌入報告基因模式小鼠的過程中，經(jīng)常要用到報告基因。常用的報告基因包括：lacZ、EGFP、zsGreen、EYFP、DsRed （DsRed2）、mRFP、mCherry、HuCD2、Thy1.1、HA tag、FLAG tag、Luciferase等。那什么時候選擇哪種reporter呢?

做小鼠胚胎發(fā)育的研究人員一般喜歡用LacZ，也就是將LacZ置于一個啟動子的調(diào)節(jié)之下。用LacZ可以進行胚胎全身染色（whole body staining），這樣可以了解一個基因在體內(nèi)的表達譜全貌。如果做細胞跟蹤，比如免疫細胞，神經(jīng)細胞等，一般喜歡用熒光蛋白。這樣一是容易對細胞進行分離（比如FACS）和體外分析，二是容易對分離的細胞進行體內(nèi)追蹤（比如Adoptive transfer）。早些年用的zui多的是EGFP和EYFP。有的時候，我們需要將兩種不同的reporter小鼠交配在一起，研究兩個基因的關(guān)系，這時可以將兩個基因采用不同的熒光蛋白進行標(biāo)記，也就是做兩種不同的模式小鼠。因為早期大家多是用EGFP，現(xiàn)在可以多做一些其它熒光蛋白的報告基因小鼠，以便跟以前研發(fā)的EGFP小鼠結(jié)合起來研究。 zsGreen和EGFP, EYFP都是綠色熒光。EGFP和EYFP很難區(qū)分開。zsGreen是一個比較穩(wěn)定的綠色熒光蛋白。DsRed和TdTomato都是紅色熒光。這兩種熒光蛋白都有報告基因模式小鼠發(fā)表。TdTomato是一個信號非常強的熒光蛋白，目前已經(jīng)有報告基因小鼠發(fā)表，對細胞/小鼠也沒有明顯的毒性。相信以后會有越來越多的小鼠用TdTomato來做報告基因。雖然mRFP和mCherry是兩個非常好的熒光蛋白，但由于它們需要584nm的激發(fā)光，所以一般的FACS儀器不能檢測到信號，需要用到LSRII這樣的儀器，而很多實驗室可能沒有這樣的儀器。也有用EBFP, ECFP做細胞實驗的，但用到小鼠上的比較少。比如需要用到紫外光來激發(fā)。如果想在一個小鼠里表達兩種熒光蛋白，是用兩種分得比較開的，比如，不要同時用EGFP和EYFP。

HuCD2和Thy1.1是細胞表面受體。HuCD2因為去掉了C-term序列，使得其失去了信號傳導(dǎo)的功能。那什么時候會用這兩種分子呢?比如我們想研究一個細胞內(nèi)蛋白基因（比如轉(zhuǎn)錄因子）的功能，經(jīng)常需要把表達這個蛋白的細胞分離純化出來。這個時候可以將HuCD2或Thy1.1報告基因放置在這個細胞內(nèi)蛋白基因啟動子下（比如加一個IRES-Thy1.1）, 這樣所有表達這個細胞內(nèi)蛋白的細胞都會在細胞表面表達Thy1.1。這樣就可以用anti-Thy1.1抗體將這一群細胞分離出來，進行后續(xù)研究。當(dāng)然也可以用anti-Thy1.1抗體進行組織切片的免疫熒光檢測。

HA、FLAG、Biotin等是細胞和生化實驗中常用的標(biāo)簽多肽或蛋白。在Western blot，免疫沉淀（Immunoprecipitation）等實驗中經(jīng)常用到，因為有非常特異的HA、Flag抗體。Biotin可以跟（Streptavidin）直接結(jié)合并用于免疫沉淀。在模式小鼠中，這些標(biāo)簽多肽或蛋白可以與要研究的蛋白做成融合蛋白。這種模式小鼠zui常被用到的是Chip-chip實驗。比如要研究一個轉(zhuǎn)錄因子的功能，就需要知道這個轉(zhuǎn)錄因子在細胞內(nèi)（正?；虼碳l件下）結(jié)合到染色體基因組DNA的位置以及結(jié)合序列。我們知道，特異性好、親和力高的抗轉(zhuǎn)錄因子的抗體非常不容易得到或制備。這個時候可以將標(biāo)簽多肽（比如FLAG）放在轉(zhuǎn)錄因子的C-term，做成融合蛋白。刺激細胞之后，對細胞進行化學(xué)交聯(lián)，并破碎細胞以及基因組DNA，然后用anti-FLAG抗體作免疫沉淀，將轉(zhuǎn)錄因子沉淀下來。zui后分析這些轉(zhuǎn)錄因子所結(jié)合的DNA段序列，從而找到該轉(zhuǎn)錄因子的在基因組上的識別序列，也就找到了該轉(zhuǎn)錄因子的作用基因。

熒光素酶做報告基因模式小鼠，一般是為了做活體成像實驗。比如在一個細胞因子啟動子下面放置熒光素酶基因。免疫小鼠之后，有些細胞或器官表達該細胞因子同時表達熒光素酶。通過注射熒光素酶底物可以檢測熒光在小鼠體內(nèi)的分布，從而得出該細胞因子在不同免疫條件下的表達情況。熒光素酶在癌癥研究中也經(jīng)常用。通過熒光活體成像可以研究腫瘤細胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。