原位微量BCA蛋白定量法

【資料簡介】

簡述：

傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)的BCA蛋白定量分析方法常規(guī)均使用試管或者微孔板進行檢測，通過對傳統(tǒng)方法進行改進，可使用BioTek公司的Take3^TM 超微量多體積檢測板進行原位微量BCA法蛋白定量分析。待測蛋白樣品和BCA工作緩沖液按照順序直接加在Take3TM板的微量定量孔處、溫浴，使用EpochTM 微孔板分光光度計進行檢測。和傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)BCA方法（BCA工作緩沖液和蛋白質(zhì)樣品體積比為20:1）相比，該方法的蛋白檢測靈敏度有明顯的提高。相比與Mini-BCA分析方法，原位分析方法更加。

介紹

BCA法是十分常用的蛋白質(zhì)比色定量方法，很多試劑供應(yīng)商都提供基于比色皿和微孔板的BCA蛋白定量試劑盒。BCA蛋白定量法相對于其它比色定量法具有操作簡單、穩(wěn)定、靈敏度高等優(yōu)點。相對于蛋白質(zhì)的固有的280nm吸收峰檢測，BCA檢測法提高了蛋白檢測靈敏度和特異性，消除了核酸的干擾，核酸干擾在對細胞裂解物或其他生物樣品進行蛋白定量時總是一個難以避免的干擾。在堿性條件下，蛋白將Cu²⁺ 還原為Cu⁺ ，Cu⁺ 與BCA 試劑形成紫色絡(luò)合物，如圖1，其吸光值與蛋白濃度成正比。測定在562nm 處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

  
圖1. BCA法蛋白質(zhì)定量。Cu（BCA）₂耦合物在592nm有一很強的吸收值，7700L/mol/cm。

近幾年開發(fā)的一些精密的檢測儀器，都可以使用短光程、微量體積的樣品進行比色定量，例如NanoDrop（ThermoFisher Scientific）。這個儀器內(nèi)置了蛋白質(zhì)280nm直接定量法，這種方法可以有效的避免浪費樣品且操作簡單。在直接蛋白定量的基礎(chǔ)上，這些儀器還發(fā)展了蛋白質(zhì)比色定量法，例如BCA法。通過調(diào)整蛋白質(zhì)和BCA工作緩沖液的相對體積比，由原來的20:1調(diào)整為1:1,這種微量定量方法轉(zhuǎn)換校準(zhǔn)曲線的工作范圍，使之更適合于微孔板或短光程檢測，這種方法叫Mini-BCA法。然而對于這些通過把樣品加在檢測基座上的儀器來講，蛋白質(zhì)和BCA工作緩沖液必須先在一個額外的試劑槽里進行混勻和溫浴，然后才能滴加到檢測基座上進行檢測。這樣會增加操作的復(fù)雜性，增加了樣品的浪費。

這里我們介紹一下如何使用Take3 超微量多體積檢測板進行原位微量BCA蛋白定量法。使用Take3 超微量多體積檢測板進行Mini-BCA法檢測操作步驟簡單，整個流程和使用典型的96孔微孔板檢測相似，直接把BCA工作緩沖液和樣品滴加在Take3板的微孔處，不需要先在其它容器混勻進行顏色反應(yīng)。這樣做的好處是可以提高操作的便捷性，每次檢測只需要2ul樣品，非常節(jié)約樣品。

實驗材料和方法檢測試劑盒（Sigma-Aldrich公司）、小牛血清（BSA）（Sigma-Aldrich公司）。我們使用兩種實驗方法來進行BCA檢測。

*種方法

按照NanoDrop技術(shù)手冊的“Mini-BCA”法。其簡要流程是：BCA檢測系統(tǒng)混合好的10ulBCA工作緩沖液和10ul的標(biāo)準(zhǔn)蛋白或待測的10μl樣品（1:1）在試管中混勻，37℃溫浴30分鐘后進行檢測。