目的基因片段的PCR擴增與克隆

【資料簡介】

1.PCR技術(shù) 
PolymeraseChainReaction聚合酶鏈反應(yīng) 
它是一種模擬天然DNA復制過程，在有DNA模板、dna聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四種dNTP的情況下，通過高溫變性（90℃－95℃，1－2min）,低溫退火（25℃－37℃，1－2min）,中溫延伸（60℃－75℃，90sec-5min）,這樣反復循環(huán)的過程中，在體外擴增特異性DNA片段的分子生物學技術(shù)。

1）、pcr反應(yīng)成分： 
taqDNA聚合酶 
引物濃度：一般0.1-0.5μmol/L 
dNTP:一般為50－200μmol/L 
Mg2+ 
模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可，但樣品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑以及能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。 
添加劑：DMSO（二甲基亞楓），提高擴增效率及特異性 
（1）理論上PCR合成產(chǎn)物的數(shù)量經(jīng)過每輪循環(huán)都將增加一倍，應(yīng)按2n的指數(shù)方式遞增，PCR反應(yīng)30輪循環(huán)后，PCR擴增應(yīng)達到230個拷貝，約109個拷貝。但由于DNA聚合酶的質(zhì)量、待擴增片段的序列及反應(yīng)系統(tǒng)的條件等各種因素的影響，實際擴增效率比預期的要低，一般可達106－107個拷貝
平臺效應(yīng)”：PCR反應(yīng)中，當引物－模板與DNA聚合酶達到一定比值時，DNA聚合酶催化反應(yīng)趨于飽和，即PCR反應(yīng)不再增加。平臺效應(yīng)在PCR反應(yīng)中是不可避免的，但一般在平臺效應(yīng)出現(xiàn)前，PCR產(chǎn)物的數(shù)量足以滿足實驗的需要。
（2）PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
PCR方法操作簡便，但影響因素頗多，因此需要根據(jù)不同的DNA模板，摸索zui適條件。主要從：
反應(yīng)的特異性、敏感性、真實性、擴增效率等四個方面衡量PCR反應(yīng)的結(jié)果。
①循環(huán)參數(shù) 變性 退火 延伸
②PCR反應(yīng)成分
（3）PCR反應(yīng)引物的設(shè)計
引物的設(shè)計在整個PCR擴增中占有十分重要的地位。