*12測定培養(yǎng)基原理

乳酸桿菌生長需要特別的營養(yǎng)，因而在非選擇性培養(yǎng)基上很難生長。維生素測定用培養(yǎng)基用于維生素的微生物法測定。該方法需要三種培養(yǎng)基：即維持培養(yǎng)基，用于保持菌種活力；接種培養(yǎng)基，用于測試菌液的制備；測定用培養(yǎng)基，用于待測維生素的定量。

*12測定用培養(yǎng)基，不含*12，但包含所有其他維生素和必要養(yǎng)分，用于萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）的生長。萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測定用菌，zui早由Capp等人描述（1）并被美國藥典和美國分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）所*（2，3）。

用已知稀釋度的*12標(biāo)準(zhǔn)品，可以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（2，3）。

測試菌液的制備是將將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，*在37°C 孵育24 小時，再離心、清洗、重懸于10 ml 生理鹽水中，再通過濁度分析或酸度分析，確定生長反應(yīng)。

  用*12的濃度及對應(yīng)的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定待測樣本中的*12的濃度。

應(yīng)非常小心地避免培養(yǎng)基和玻璃器具的污染。應(yīng)使用潔凈的無去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。

用于接種的測定菌應(yīng)在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

*12測定培養(yǎng)基應(yīng)用

*12測定用培養(yǎng)基*采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測定用菌，進行*12的微生物法測定。

培養(yǎng)基組分

成分                                     克/升

無維生素酸水解酪蛋白                 15.000

葡萄糖                               40.000

天*                           0.200

醋酸鈉                               20.000

抗壞血酸                             4.000

L-*                             0.400

DL-*                            0.400

硫酸腺嘌呤                           0.020

*                               0.020

黃嘌呤                               0.020

核黃素（*2）                   0.001

鹽酸硫胺素                           0.001

*                               0.00001

*                                 0.002

對氨基苯甲酸（PABA）                0.002

*                               0.001

鹽酸吡哆醇                           0.004

鹽酸吡哆醛                           0.004

*                           0.0008

*                                 0.0002

磷酸二氫鉀                           1.000

*                           1.000

*                               0.400

氯化鈉                               0.020

*                             0.020

硫酸錳                               0.020

聚山梨酯80                           2.000

鹽酸*                           0.020

zui終pH值 (25°C)                     6.1±0.2

質(zhì)量控制

Ø外觀——奶油色至黃色，具均勻性，傾向形成可容易分解成粉末狀的軟塊

Ø制備好的培養(yǎng)基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀

Ø配比濃度——在25°C下8.5%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.1±0.2

ØpH值——5.90-6.30

配置

稱取8.45g干粉培養(yǎng)基溶于100ml蒸餾水，必要時加熱使培養(yǎng)基*溶解。混勻，使輕微的沉淀均勻分布。測定時，分裝試管，每管為5ml培養(yǎng)基（包含標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品）。加蒸餾水，使總體積達到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻培養(yǎng)基。每個試管(10 ml)的*12水平為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2 ng時，均可獲得滿意結(jié)果。

培養(yǎng)反應(yīng)

進行微生物法測定*12。采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830），35-37°C孵育18-24小時。

生長狀況

隨著測定管標(biāo)準(zhǔn)品水平升高，（美國藥典*12標(biāo)準(zhǔn)水平，0，0.025,0.050，0.075,0.1,0.125,0.150,0.2ng)，目標(biāo)菌生長逐漸遞增，伴隨著620nm處吸光度的增加。