構(gòu)建人白細(xì)胞介素32γ(IL-32γ)基因重組腺病毒載體,并檢測(cè)其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá).方法從表達(dá)質(zhì)粒pDONR223中擴(kuò)增目的片段IL-32γ,定向克隆至穿梭載體pShuttle-GFP-CMV獲得pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ,經(jīng)I-CeuI+I-SceI雙酶切處理后轉(zhuǎn)移至腺病毒載體pAdxsi,得到Ad-IL-32γ進(jìn)行PCR鑒定及滴度測(cè)定.將Ad-IL-32γ轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞HEK293中,通過(guò)觀察綠色熒光蛋白(GFP)確定Ad-IL-32γ的轉(zhuǎn)染效率,并通過(guò)Western印跡檢測(cè)目的基因IL-32γ的表達(dá).結(jié)果目的片段IL-32γ轉(zhuǎn)入穿梭載體后,酶切鑒定pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ正確.酶切穿梭載體將目的基因片段克隆至腺病毒載體pAdxsi得到Ad-IL-32γ病毒載體,酶切鑒定證實(shí)構(gòu)建成功.Ad-IL-32γ病毒滴度為2×1010pfu/ml.轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞通過(guò)觀察GFP判斷轉(zhuǎn)染效率,并通過(guò)Western印跡證實(shí)其在HEK293中的表達(dá).結(jié)論成功構(gòu)建IL-32γ重組腺病毒載體并證實(shí)其能在體外有效表達(dá)IL-32γ蛋白,為進(jìn)一步基于Ad-IL-32γ的基因治療研究奠定基礎(chǔ).
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