siRNA/shRNA質(zhì)粒載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù) 

RNAi (RNAinterference, RNA干擾)技術(shù)，即將與內(nèi)源 mRNA 編碼區(qū)同源的小片段（19 －23bp）外源雙鏈 RNA（double s`tranded RNA ）導(dǎo)入細(xì)胞中，通過一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)引發(fā)細(xì)胞中相應(yīng) mRNA 的降解，從而導(dǎo)致特定基因表達(dá)沉默的一種技術(shù)。RNAi的作用提供了一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制特異基因表達(dá)的技術(shù)手段，有助于研究該基因在生物模型系統(tǒng)中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成為病毒性疾病、遺傳性疾病以及腫瘤等的基因治療研究的一種手段。

基本原理示意圖

siRNA/shRNA構(gòu)建技術(shù)服務(wù)

本公司提供siRNA 載體的構(gòu)建服務(wù)，siRNA 載體可以在細(xì)胞內(nèi)直接轉(zhuǎn)錄出shRNA ，其干擾效果等同于siRNA ，而且能夠解決 siRNA干擾時間短的缺點。您只需提供需干擾基因的詳細(xì)信息，包括基因的 mRNA 序列，Genbank Accession No. 和所屬物種，本公司負(fù)責(zé)設(shè)計3條針對目的mRNA的siRNA 靶序列，在短時間內(nèi)構(gòu)建三個可用于目的mRNA干擾實驗的siRNA 載體?？梢詾槟?jié)省大量的時間與精力。此方法是多種siRNA制備方法中  一可以進(jìn)行長期基因沉默研究的方法。

閃晶生物siRNA載體構(gòu)建服務(wù)程序：
1. siRNA表達(dá)載體的選用：
本公司選用的siRNA 表達(dá)載體含  抗性基因和GFP綠色螢光標(biāo)記，可以建立穩(wěn)定表達(dá)系，同時可以實時監(jiān)測載體在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。載體中還含有Amp抗性基因，可以無限擴(kuò)增。
2. 設(shè)計siRNA靶序列
A 、根據(jù)目的mRNA序列，設(shè)計3條RNA干擾靶序列，靶序列一般為19 － 21nt 長。
B 、對于每條選定的siRNA 靶序列，設(shè)計 siRNA 正義鏈和反義鏈，以 loop(9nt) 相連，稱為 shRNA（short hairpin RNA）。
C、陰性對照的設(shè)立.
3. 合成模板：
合成每條編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，退火 DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點，同時兩端分別設(shè)計 BamHI 和 HindIII 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamHI 和 HindIII 酶切位點之間。
4. siRNA 空載體用BamHI和HindIII雙酶切后，1 ％瓊脂糖凝膠電泳，回收線性載體。
5. 連接與轉(zhuǎn)化：
把退火的DNA模板雙鏈連接到線性載體中。采用T4連接酶，插入片斷與載體的摩爾比約為 3 ： 1 。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，在LB Amp培養(yǎng)基上涂板，37 ℃培養(yǎng)過夜。
6. PCR 鑒定
7. 測序鑒定
8.柱抽提陽性克隆載體并定量。

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