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一、實驗?zāi)康?/strong>
在DNA上以限制性內(nèi)切酶的酶切位點作為標記所繪制的物理圖譜就是限制性內(nèi)切酶圖譜，限制性內(nèi)切酶圖譜與其他相關(guān)資料聯(lián)合使用，可用于基因克隆、分離和基因功能研究。
二、實驗原理
（一）酶切圖譜的構(gòu)建
限制性內(nèi)切酶在DNA上有特異的識別和切割位點，可將DNA切開而得到兩個或兩個以上的大小不同的片段，這些片段可通過電泳分離并檢測其大小。雙酶切法酶切圖譜構(gòu)建是使用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對同一個DNA分子進行單酶切和雙酶切，將所得的片段進行對比組裝，對交替區(qū)域進行加減以確定酶切位點的相對位置。
假如n代表某限制性內(nèi)切酶在DNA上的酶切位點數(shù)，F(xiàn)代表*酶切后的片段數(shù)，則線形DNA單酶切后:F=n+1,而環(huán)狀DNA單酶切的F=n。若使用雙酶切時，所得的片段中有兩類：一是與單酶切片段*相同的保留片段：二是單酶切片段備再切割后小片段，這些的片段的分子量之和等于單酶切片段的分子量。將以上片段電泳后，遵循以下“三三"規(guī)則進行分析：
1、區(qū)分三類片段，并做好標記：
（1）消失片段Fd(Disppeared fragment)，即單酶切片段經(jīng)雙酶切后消失的片段。
（2）保留片段Fr(Remaiined fragment)，即單酶切片段經(jīng)雙酶切后仍保留的片段。
（3）接頭片段Fl(Linker fragment)：即雙酶切后出現(xiàn)的新片段，由Fd再切割而來。
2、分析三類片段的關(guān)系：
（1）兩種酶的Fd總數(shù)相同，而Fr總數(shù)不等。
（2）Fd的片段總數(shù)為的1/2。
（3）兩種酶Fl的相同。
3、排列三類片段，構(gòu)建酶切圖譜：
（1）首尾排列：每種酶Fd的片段的首尾只能接Fl片段。
（2）夾心排列：一種酶的Fr片段只夾于另一種酶的兩個Fl片段中間。
（3）鑲嵌排列：兩種酶的Fd段彼此鑲嵌排列，由共同的Fl片段連接。
此外，應(yīng)注意：
① 若*種酶的單酶切片段數(shù)為F1，第二種酶切片段數(shù)為F2，雙酶切的片段數(shù)為F，則線形DNA的F=(F1+F2)-1，而環(huán)狀DNA的F=F1+F2。
② Fd通常等于幾個Fl之和。
（二）重組子的酶切分析
重組子是插入了外源DNA片段的載體分子。與空載的載體相比，其酶切圖譜出現(xiàn)了變化。所以，檢測疑是重組子的酶切圖譜可以幫助確定是否是真的重組子，并可以確定插入片段的插入方向，為基因克隆的結(jié)果鑒定和進一步的操作提供依據(jù)。
三、實驗內(nèi)容
（一）酶切圖譜的構(gòu)建
1、用兩種限制性內(nèi)切酶分別對同一DNA分子進行*單酶切。
2、取適量的單酶切產(chǎn)物用另一種酶進行*酶切，得到雙酶切產(chǎn)物。
3、將以上酶切產(chǎn)物進行電泳，然后分析電泳結(jié)果，構(gòu)建這兩種的酶切圖譜。
（二）重組子的酶切分析
1、提取疑是重組子的DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進行酶切。同時做非重組子對照。
2、分析酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果，繪制酶切圖譜，判斷是否是真重組子。
四、注意事項
1、實驗前必須查閱相關(guān)資料，了解和掌握雙酶切法的原理和構(gòu)建圖譜的方法。根據(jù)所提供的材料設(shè)計詳細的實驗步驟，以達到的實驗結(jié)果。
2、實驗中應(yīng)確保*酶切，并獲得良好的電泳分離結(jié)果。
3、重組子分析時應(yīng)在了解插入片段的一般資料的基礎(chǔ)上確定所需的限制性內(nèi)切酶，并對酶切結(jié)果作出預(yù)期；zui后用實驗結(jié)果進行驗證。