可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）試劑盒說明書

分光光度法 25 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游離態(tài)存在于質(zhì)體基質(zhì)中，催化淀粉鏈延長，主要負責支鏈淀粉的合成。
可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）試劑盒說明書測定原理

SSS 催化 ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時生成 ADP，在反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還原為NADPH，NADPH 生成量與前一步反應(yīng)中 ADP 生成量呈正比，340nm 下測定 NADPH 增加量即可計算 SSS 活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）試劑盒說明書提取液：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；
液體一：7mL×1瓶，4℃保存；
液體二：4mL×1 瓶，4℃保存；
液體三：8mL×1 瓶，4℃保存；
粉劑一：1 支，4℃保存；
粉劑二：1支，4℃保存；
粉劑三：1 支，-20℃保存；
粉劑四：1 支，4℃保存；
粉劑五：1 支，4℃保存；
粉劑六：1 支，-20℃保存；
粉劑七：1 支，-20℃保存；
粉劑八：1 支，4℃保存；
粉劑九：1 支，4℃保存；
粉劑十：1 支，-20℃保存；
試劑一：液體×1 支，-20℃保存；臨用前加入 250μL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 250μL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

反應(yīng)液Ⅰ的配制：臨用前取液體一、粉劑一、粉劑二和粉劑三各一支，依次把粉劑一、粉劑二和粉劑三轉(zhuǎn)移到液體一中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。反應(yīng)液Ⅱ的配制：臨用前取液體二、粉劑四、粉劑五、粉劑六和粉劑七各一支，依次把粉劑四、粉劑五、粉劑六和粉劑七轉(zhuǎn)移到液體二中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

反應(yīng)液Ⅲ的配制：臨用前取液體三、粉劑八、粉劑九和粉劑十各一支，依次把粉劑八、粉劑九和粉劑十轉(zhuǎn)移到液體三中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
粗酶液制備

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在 EP 管中按順序加入下列試劑

試劑名稱（μL）    測定管
    
樣本    150
    
反應(yīng)液Ⅰ    270

混勻，30℃保溫 20 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

反應(yīng)液Ⅱ    150

混勻，30℃保溫 30 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），
    冰浴冷卻，10000g 25℃離心 10min，取上清液
上清液        450
反應(yīng)液Ⅲ        300
試劑一        10
試劑二        10

混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計算 ΔA=A2-A1。注意：反應(yīng)液Ⅰ如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）試劑盒說明書SSS 活性計算

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

SSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=522×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

SSS 活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T×稀釋倍數(shù)=522×ΔA÷W 
V 反總：反應(yīng)體系總體積，5.7×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.15 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.71；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。