1．熒光素酶報告基因質粒的構建
靶基因3’UTR的獲得。3’UTR序列是指從Mrnaz終止密碼子后的*個堿基開始到mRNAzui后一個堿基（通常是polyA結尾）。模板可采用相應物種的cDNA或基因組。在選擇模板時要注意：一般來講，cDNA適于所有的3’UTR擴增，但有時3’端AT過多導致引物設計困難時，可以考慮用基因組做模板。但是基因組做模板的前提是靶基因3’UTR由一個外顯子組成。一般盡可能全面的擴增3’UTR，但如果3’UTR過長或引物設計困難，可以選取包括miRNA結合位點的一段3’UTR。

2．熒光素報告基因質粒轉染
開始做報告基因實驗前，你還需要準備以下材料：
1）TK質粒，作為共轉染的內參。
2）miRNA的過表達質粒或合成的miRNA。質粒的濃度盡量在500ng/ul以上，合成的miRNA稀釋到20uM。
3）狀態(tài)良好的細胞。
常用24孔板進行報告基因實驗。分細胞時保證細胞鋪板均勻（搖勻細胞的方法見細胞培養(yǎng)的方法），每孔細胞數目相當。以293ET細胞為例，我們轉染的密度一般在60-80%作用，如果用威格拉斯轉染試劑，細胞密度可以稍高些，因為轉染后細胞死亡較多。

轉染
轉染時必須配總體系再依次分成小體系。這一步決定著每個孔的平行性和實驗的可重復性。轉染核酸用量為每孔：luc-3’UTR 200ng；TK 50ng；miRNA-pcDNA3.1 1ug或合成的miRNA 2.5ul（終濃度100nM）。Vig每孔用量為1ul，lip2000為2ul。轉染后4-6h換液。如果用vig轉染必須及時換液，否則細胞會尸橫遍野。注意設立合理的對照，通常用pcDNA3.1（或miRNA NC）代替miRNA-pcDNA3.1（miRNA）做miRNA的對照。

收細胞
轉染24-48h可以收取細胞。用生理鹽水或PBS清洗細胞兩次，因293細胞極易脫落，建議操作溫柔，如果對自己的操作沒有自信，可以增大生理鹽水量只洗一次。之后吸干生理鹽水。每孔加入80ul 1Xpassive buffer（裂解液的量可視細胞數目稍作調整），室溫搖20min，如果細胞裂解充分會看到白色粘稠狀細胞碎片。如果不馬上測，可連同24孔板凍于-80度，測時再取出解凍。-20度可保存一周。4度可保存一天。

3．測定熒光素酶活性

測定熒光素酶活性需使用質量好的ELISA試劑盒，雙熒光素酶報告系統(tǒng)：bufferII為螢火蟲熒光素酶的底物，測量數值為我們的報告基因的活性；S&G buffer 作用是淬滅螢火蟲熒光素酶的活性并提供海腎熒光素酶反應的緩沖環(huán)境，測定的數值為內參的活性。測定時，取細胞裂解液8ul到96孔板中（的96孔板）上機測量。每種底物每孔加30ul。

4．結果分析
測定熒光素酶后會返回三個值：螢火蟲熒光素酶活性、海腎熒光素酶活性及兩者的比值。比值將作為zui后的分析數據，反映了該孔報告基因的相對活性。通常將對照歸一為1，實驗組與其相比取相對值。此相對值用于zui后作圖和統(tǒng)計分析。2.GFP報告基因實驗