(一)試驗(yàn)原理

    新生哺乳動(dòng)物胃腸道的生長(zhǎng)發(fā)育非常迅速，這與初乳的攝入有關(guān)，初乳中含大量多肽類生長(zhǎng)因子如胰島素等。本實(shí)驗(yàn)通過體外犢牛小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)法，用細(xì)胞增殖率和葡萄糖吸收率作為細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及功能成熟的指標(biāo)，探討胰島素或其他生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響，同時(shí)為新生胃腸道營(yíng)養(yǎng)發(fā)育生理研究提供研究方法。

(二)材料

1．待檢藥物胰島素(o．01μg／ml、0．1μg／ml、1μg／ml、10μg／ml及50μg／m1)。

2．動(dòng)物出生1日齡以內(nèi)未吮乳的中國(guó)荷斯坦?fàn)俟！?/p>

3．試劑DMEM／F12培養(yǎng)液、DMSO、臺(tái)盼藍(lán)、15％NCS、葡萄糖。

4．器材37℃水浴箱、酶標(biāo)儀。

(三)實(shí)驗(yàn)方法

1．細(xì)胞分離和培養(yǎng)出生1日齡以內(nèi)未吮乳的中國(guó)荷斯坦?fàn)俟Ｔ讱⒑蠓叛?，無(wú)菌條件下取十二指腸約10cm，迅速放人37℃生理鹽水中。按照Evans方法制取小腸細(xì)胞，用染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，存活的細(xì)胞活力大于85％時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞按1×105／ml接種于24孔培養(yǎng)板上，在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。48h后更換為含不同濃度胰島素(0．01μg／ml、O．1μg／ml、1μg／ml、lOμg／ml及50μg／ml)的DMEM／F 12培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)液作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，測(cè)定細(xì)胞增殖率。

2．細(xì)胞增殖率的測(cè)定 各組細(xì)胞更換培養(yǎng)液培養(yǎng)。72h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μl無(wú)血清的DMEM／F12及200μl 0．05％MTT，在5％C02、37℃孵箱中培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液和MTT，每孔加入O．5ml DMSO，用酶標(biāo)儀測(cè)定0D540。

3．葡萄糖吸收率的測(cè)定配制葡萄糖濃度為4mg／ml的生理鹽水溶液，用其稀釋胰島素，使之濃度分別為O．Olμg／ml、O．1μg／m1、1μg／ml、10μg／ml及50μg／ml。細(xì)胞分離后在含15％NCS的DMEM／F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，分別用各實(shí)驗(yàn)組生理鹽水孵育細(xì)胞30min，然后按試劑盒要求測(cè)葡萄糖吸收量(葡萄糖吸收量=總葡萄糖含量一剩余量)。

(四)結(jié)果與分析

    濃度為O．01μg／ml的胰島素作用很小，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0．05)，無(wú)促細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞吸收葡萄糖的作用。隨著濃度的增加，胰島素的促增殖作用及促細(xì)胞吸收葡萄糖的作用逐漸增強(qiáng)。但當(dāng)胰島素濃度達(dá)到50μg／ml的超生理濃度時(shí)，胰島素反而抑制細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞吸收葡萄糖。