1：RIP試驗需要注意什么?

(1)防止RNA與蛋白非特異性結(jié)合。(2)避免RNA蛋白質(zhì)結(jié)合被破壞。

(3)避免外源RNAse污染。(4)抑制內(nèi)源RNase的活性。

(5)選擇適合做RIP的抗體。(6)避免RNA結(jié)合蛋白的降解。

2：為什么抗體無法沉淀RIP裂解液中的目標蛋白?

(1)行IP或者WB，測試抗體可以與目標RBP結(jié)合。

(2)另選一個能與抗原其他表位結(jié)合的抗體。

(3)盡可能選用密理博RIPAb+抗體。

(4)稀釋抗體成濃度梯度，進行IP測試。

(5)4℃過夜孵育抗體與RIP裂解液。

(6)確定抗體類型與Protein A/Protein G匹配。

3：提取RNA時，蛋白酶k消化不*是什么原因?

當進行蛋白酶K消化時，確保水浴溫度應設(shè)置在55℃左右，在65℃以上孵育會導致蛋白酶K失活。

4：提取RNA后，A260/A280比值偏離1.8~2.2區(qū)域是什么原因?

(1)需要縮短酚氯仿提取RNA的時間間隔。

(2)測試提純后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA發(fā)生了降解。

5：做RIP的時候和beads孵育的lysate的濃度如何確定?有些動物的文獻提到用細胞板數(shù)細胞個數(shù)，想知道如果用蛋白濃度的話，大概在什么數(shù)量范圍的蛋白總量對應50 ul BEADS?

50 ul beads對應的是一個reaction，而我們推薦一個reaction是100ul裂解上清(2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到)，所以只需要在裂解前計數(shù)一下，并按括號中的比例加入裂解buffer，后續(xù)100 ul裂解上清就是一個reaction的蛋白用量。不建議通過裂解后測蛋白濃度的方法進行配比。

6：RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復合物嗎?

理論上，可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本，再進行RIP實驗。但需要特別注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。

7：因為RIP做完得到的是RNA序列，要做后續(xù)檢測，比如測序、判斷目標序列位置等，是不是都必須要做RT-PCR，得到逆轉(zhuǎn)錄的DNA后，后面就跟ChIP相同了?

常見的用real time qRT-PCR。如果對照的目的是保證兩個樣品間加入的細胞量一致或者進行定量，理論上說，使用input作為判別，計算不同樣品上樣量的差異。如果對照的目的是為了看IgG以及目的抗體富集的非特異性mRNA的量的話，那么可以找一個確定不會與目的抗體結(jié)合的RNA片段設(shè)計primer進行qPCR，用來看IgG以及目的抗體拉下來的背景情況。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同(如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等)。

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