亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說(shuō)明書

For Research Use only

僅供研究用

貨號(hào)：QYS-232029

分光光度法 50管/24樣

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

亞硝酸還原酶（NiR）試劑盒測(cè)定意義

硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或 NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對(duì)生物體的毒害作用。

亞硝酸還原酶（NiR）試劑盒測(cè)定原理

亞硝酸還原酶可將 NO₂^—還原為 NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的 NO₂^—減少，即 540nm 處吸光值的變化可反應(yīng)亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品

天平、、研缽、可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、低溫離心機(jī)、1mL 玻璃比色皿。

的組成和配制

提取液：液體 80mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑 1 瓶，4℃保存。 臨用前加 12mL 蒸餾水溶解。

試劑三：液體12ml×1 瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）。

試劑四：液體25ml×1 瓶，4℃避光保存。 （如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）。

試劑五：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

工作液：臨用前，根據(jù)用量將試劑四 和試劑五 按 1:1 的比例混合。

酶液提取

• 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
• 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
• 注意：空白管只需測(cè)定一次。
• 計(jì)算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.3594x +0.0072，R² = 0.9997

x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL）y為吸光值（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

1．按照蛋白含量計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)還原 1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h/mg prot）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V 反總÷（V 樣×Cpr） ÷T= 1.47×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管+0.0072）÷Cpr

2.  按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每小時(shí)還原 1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h/g  鮮重）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)+0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（W×V 樣÷V樣總）÷T=1.47×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管+0.0072）÷W

• 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原 1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h/10⁴ cell）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)+0.0072÷1.3594×V 反總÷（細(xì)胞數(shù)量 ×V 樣÷V 樣總）÷T= 1.47×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管+0.0072）÷ 細(xì)胞數(shù)量

V 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.2mL；V 樣：體系中加入樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒注意事項(xiàng)

• 配制好的試劑三、試劑四 3 天內(nèi)使用完。
• 若吸光值超過(guò)3，將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)
• 嚴(yán)格控制顯色時(shí)間，否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.03umol/mL-1.5umol/mL。
• A空白管-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）線性范圍為0.02-3

注：電子試劑盒說(shuō)明書僅供參考、具體請(qǐng)參考試劑盒紙質(zhì)版說(shuō)明書。