平時(shí)在實(shí)驗(yàn)室zui常聽到的一句話就是“今天某某試驗(yàn)沒(méi)做好是為什么？今天某某試驗(yàn)沒(méi)出結(jié)果是什么原因？今天某某試驗(yàn)為什么會(huì)是這樣的呢？" 等等。然后仔細(xì)一查找原因，往往是由于操作上面的不認(rèn)真，或是一些小小的細(xì)節(jié)沒(méi)有注意到。以下是集各路朋友的一些經(jīng)驗(yàn)，與大家分享：
11. 在把蛋白膠做成干膠時(shí)，很多時(shí)候會(huì)因?yàn)橛袣馀菔鼓z裂掉，我的經(jīng)驗(yàn)是在做膠時(shí)加上層膜前在膠上多加些水就不容易進(jìn)氣泡了，還有就是高溫烘膠，我喜歡放到60度烘箱里烘，ELISA試劑盒這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會(huì)有影響，呵呵，這是經(jīng)驗(yàn)之談，我從來(lái)都沒(méi)失手過(guò)，大家可以試試
12. 做大腸表達(dá)時(shí)確定蛋白是否表達(dá)一般要煮樣做誘前誘后檢測(cè),但很多時(shí)候煮出來(lái)的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用8M Urea重懸細(xì)菌再煮效果會(huì)有極大改善.
注:不能用Gu-HCl代替
13. 我也推薦幾個(gè)偷懶的方法
1. 做SDS-PAGE跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要>1h,所以如果想第二天睡個(gè)懶覺(jué)而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會(huì)有氣體,所以需要加一點(diǎn)電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放4度過(guò)個(gè)夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國(guó)外好多公司出售腳既是如此,可以保存上星期.
2 .配置分離膠或者非變性膠時(shí)因膠凝時(shí)收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入4度以降低凝聚速度,而將凝膠放入37度促聚,并隨時(shí)用4度加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成~10度角也可以減少收縮的影響.
3 .推薦一個(gè)節(jié)約抗體/時(shí)間的做法:
同時(shí)跑2塊膠,同時(shí)轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入同一封口膜同時(shí)封閉,同時(shí)一抗二抗(是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時(shí)間幫它們翻個(gè)身以保證兩張膜的正面都有機(jī)會(huì)與液體充分接觸.一起洗膜(可以稍微加強(qiáng)洗膜也可以不做.我zui多一張盤子里放4張膜而沒(méi)有影響洗膜).可分別或同時(shí)壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時(shí)間而不會(huì)影響結(jié)果.
或者另外一個(gè)就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾張膜呢.但每次都會(huì)減弱,效果不如上面一種方法.
14.做western blotting 轉(zhuǎn)膜時(shí)，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝 好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶，方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染maker很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過(guò)要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了，以防m(xù)aker失去參照價(jià)值。
15. 超濾zui合適用于蛋白的濃縮，更換緩沖液和除鹽，對(duì)于按照分子量進(jìn)行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實(shí)是有很大差別的
16. 關(guān)于Western Blot
1）器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，ELISA試劑盒尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來(lái)水反復(fù)沖洗，確保無(wú)洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2－3遍，然后用去離子水沖洗一遍。zui后用95％酒精再擦一遍后晾干備用。
2）配膠現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1－2次即可。
17.跑蛋白page的時(shí)候，一開始用加樣針，太麻煩，發(fā)現(xiàn)用20ul槍+普通小白槍頭點(diǎn)，非常省事。另外，點(diǎn)樣時(shí)有可能看不清孔在哪，看遠(yuǎn)離你的那面膠，孔有反光的。點(diǎn)樣也點(diǎn)你對(duì)面的那塊膠，省的總低頭，干咱這行的容易得頸椎呀，愛(ài)惜自己。
18. 垂直電泳時(shí)，可在電泳糟中放入*小瓶等，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。
19. 我們有時(shí)要沉淀東西時(shí)，由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有沒(méi)沉淀下來(lái)東西，由于量很少，不好觀察，所以離心時(shí)建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部位，這樣離心后就可直接觀察那有沒(méi)有沉淀，避免滿管子找，另外看沉淀時(shí)可以對(duì)光看，這樣就是顆粒狀的細(xì)小沉淀也能看見的。
20. 大家都知道PMSF有劇度，以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實(shí)也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積，到達(dá)你所要的濃度。這樣就避免了你長(zhǎng)時(shí)間和它接觸。
21. 跑好SDS-PAGE膠的一些體會(huì)。
1. 清洗好玻璃板，不要偷懶，很多時(shí)候跑完電泳撬膠時(shí)會(huì)因?yàn)椴ＡО宀桓蓛裟z粘在板上把膠撬破。
2. 配膠時(shí)不要反復(fù)用槍混，稍微搖混就可以了，用槍混多次會(huì)導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。
3. AP分裝成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。
4. 倒膠時(shí)把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因?yàn)槲⒘康乃嬖跁?huì)影響配的膠濃度。
5. 盡量不用過(guò)個(gè)夜放室溫或者四度的膠，也回影響膠 的分離效果。
6. 電泳完撬膠時(shí)根本不需要用撬膠板，在一平皿里裝好水，把有膠一面的放在水中晃動(dòng)幾次膠很容易就脫落下來(lái)，一點(diǎn)沒(méi)有問(wèn)題，方便的很。
7. 點(diǎn)樣時(shí)樣品別忘了離心這步，因?yàn)樯蠘雍泄腆w沉淀會(huì)影響電泳圖分辨效果。
8. 盡量在冰浴狀態(tài)下跑。
22. 做2-DE做的比較多，總結(jié)了幾個(gè)小竅門：
1.一向電泳時(shí)，鹽離子容易聚在 膠槽的兩側(cè)．剪一小段ＩＰＧ膠條放在兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了．避免一向電泳不好影響zui后實(shí)驗(yàn) 結(jié)果．
2. SDS－PAGE時(shí),在灌膠之前,一般大家都會(huì)用凡士林封底, 在SDS－PAGE
電 泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,我的經(jīng)驗(yàn)是:不用凡士林,取少量未加Ap的分離膠,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠了.方面,效果好!
23. 蛋白質(zhì)純化時(shí)，蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加pmsf，建議在上柱子洗脫的時(shí)候也加pmsf（蛋白降解抑制劑），一定要用之前再加。
24. 做透析的時(shí)候，拿一個(gè)5ml的槍頭或者是其他類似的東西，剪短，穿過(guò)個(gè)塑料泡沫之類的面積比燒杯大東西，然后把透析帶一端扎緊，另一端開口綁緊在5ml槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過(guò)來(lái)綁成u字型。這樣就可以用1ml的槍穿過(guò)5ml的槍頭的孔，另一只手調(diào)整透析帶，來(lái)加樣取樣，省去了總綁透析帶的麻煩，對(duì)同一個(gè)蛋白大量多次透析非常方便
25. *次發(fā)貼說(shuō)一下自己的小經(jīng)驗(yàn)，希望版主能給我一分，每次看到好東西因?yàn)闆](méi)分都沒(méi)法下，好羨慕有分的人啊。當(dāng)然也不能不勞而獲，說(shuō)一下自己的實(shí)驗(yàn)技巧給大家分享。
1. 配SDS-PAGE膠時(shí)，用槍頭混勻比較麻煩，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效果也不好?？梢约粢恍《螉A文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了，直接灌膠即可。
2. 上面的站友也說(shuō)過(guò)，上樣用黃槍頭就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試。
3.電泳后考馬斯亮藍(lán)染色一般要1h到2h，脫色也要2h左右，麻煩的很?，F(xiàn)在給大家說(shuō)一個(gè)簡(jiǎn)單的方法，是我從一個(gè)師姐那里學(xué)到的。
加入染色液后，先放入微波爐里加熱5-10秒，使染色液微熱即可（千萬(wàn)不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了）。然后放水平搖床上搖20分鐘，zui多半小時(shí)就染好了。
脫色也很簡(jiǎn)單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn)，不如那樣清楚，只要電泳時(shí)比平時(shí)多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。方便快捷！
放心，反復(fù)煮膠不會(huì)把膠煮壞的。
26. 我也說(shuō)說(shuō)我的小經(jīng)驗(yàn)?？赡艽蠹叶贾?，請(qǐng)別笑話我。
1、配膠時(shí)一定要掌握好時(shí)間，不要因?yàn)檫^(guò)度趕時(shí)間，而造成以后的條帶粗大，壓不成條帶，且消耗很多試劑和時(shí)間。
2、加樣時(shí)，沖洗加樣器可用雙蒸水，用電泳液會(huì)使加樣器中有很多的泡沫?；蛟S是因?yàn)镾DS的原因吧？
3、對(duì)于大分子蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜過(guò)個(gè)夜更好。濾紙的張數(shù)可以適當(dāng)減少。
4、在跑樣時(shí)同時(shí)加入MARKER有助于正確識(shí)別所需的蛋白位置，減少NC膜的消耗。
5、一抗、二抗的濃度不要太高。
6、做ECL顯影時(shí)，根據(jù)熒光的亮度調(diào)整時(shí)間。泡完顯影液，膠片應(yīng)用水洗一下，以減少定影液變黃。
7、和有經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)交流，也是非常重要的。知識(shí)的交流有助于試驗(yàn)的成功。
這是我目前的一點(diǎn)拙見。
27. 推薦一個(gè)省質(zhì)粒試劑盒硅膠柱與溶液的方法：
所有試劑使用手提質(zhì)粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替試劑盒的solution1、2、3），然后一比一的與飽和*或碘化納（代替結(jié)合緩沖液）混合，就可以讓質(zhì)粒在硅膠上結(jié)合，而試劑盒的硅膠柱可以重復(fù)使用，沒(méi)有試劑盒溶液量的限制，只要是一樣的質(zhì)粒我想提幾管就提多少。
順便說(shuō)一句硅膠柱也可以用自己買的硅膠粉末代替，離心后倒掉硅膠柱上面的上清就可以，用起來(lái)不象柱子方便。效果比手提的要好要快
28. 做WB時(shí),樣品比較多, 又怕放時(shí)間長(zhǎng)了對(duì)蛋白樣品不好,而且確定以后肯定要做某個(gè)抗體,只是一時(shí)沒(méi)有決定.那么你可以選擇先做SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)膜. 然后把PVDF膜涼干, 放四度保存. 以后拿出來(lái)封閉后,加抗體就行了. 蛋白在膜上,且已經(jīng)分離, 比保存在BUFFER里面的蛋白肯定更可靠。29. 今天作his純化的時(shí)候，又琢磨了一個(gè)竅門，與大家分享。我得樣品比較多，幾百ml，而柱子不夠大，只有10幾ml，跑來(lái)跑去的上樣，還總得記著，太麻煩了。于是，我就刷干凈了一個(gè)燒杯，裝了我的樣品，找了一個(gè)細(xì)膠皮管，當(dāng)連通器，就像魚缸換水一樣，用5ml槍在一頭一吸，液體流出來(lái)，放到純化柱里，調(diào)好燒杯的位置，兩個(gè)液面一樣平了，上了好幾個(gè)小時(shí)了，沒(méi)有問(wèn)題，現(xiàn)在調(diào)低速度，過(guò)個(gè)夜上樣
30. 能導(dǎo)致PAGE膠不凝的原因主要有三個(gè)：
1、配膠中用到的主要試劑的配置。
主要就是30％的丙稀酰胺的配置。 粉末狀的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不應(yīng)該超過(guò)一年，因?yàn)楸□０窌?huì)吸潮水解，這樣以來(lái)丙烯酸的含量就會(huì)加大，從而導(dǎo)致page膠不凝。
2、溫度。
溫度高時(shí)凝固快，但是亦不宜過(guò)高，因?yàn)闇囟茸兓瘯?huì)影響交連物的孔徑大小。所以溫度在25度zui為合適。
3、氧氣。
氧氣是凝固的終止劑，所以不能讓膠中出現(xiàn)氣泡。
雖然都是些看起來(lái)聽低級(jí)的錯(cuò)誤，但是不注意還是會(huì)犯。
31. 我做2維蛋白電泳，也有些心得：
1、向電泳玻璃板內(nèi)加入膠條時(shí)，先在縫隙中加入配好的溴芬蘭緩沖液，要加滿，再將膠條貼后面玻璃板壁用薄塑料片將膠條緩緩?fù)葡轮聊z上緣，這樣可以很好的避免膠條下形成空氣泡。
2、 能做出好的圖譜已經(jīng)很不容易了，如果在掃圖時(shí)撕破實(shí)在可惜，所以掃圖要小心，將凝膠轉(zhuǎn)移到掃描儀時(shí)可以用塑料隔片在下面托著，同時(shí)保持有些水，這樣就安全多了。
32. 湊個(gè)熱鬧說(shuō)兩句吧
1、sds-page膠如果配好裝好倒入內(nèi)槽液以后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)槽液稍有滲漏，可以把外槽液多加一些，加滿，加到與內(nèi)槽液相齊，這樣就可以繼續(xù)正常跑膠，不用浪費(fèi)已經(jīng)加進(jìn)去的內(nèi)槽液
2、至于染色脫色的問(wèn)題，我們這里一直是染色：加熱半分鐘，搖20分鐘；如果染液不是新配的，就加熱半分鐘搖十分鐘，涼透了再重復(fù)一次即可
脫色也一直是用去離子水煮兩三次即可
3、不知道大家都是怎么做酶切的，我的體會(huì)是，酶切質(zhì)粒時(shí)，兩個(gè)酶分別單酶切比直接雙酶切效果要好很多。我有一次雙酶切兩次都沒(méi)連出來(lái)，后來(lái)分步單酶切，連接效率幾乎100%。
可以*個(gè)酶切完后直接把體系熱失活，（根據(jù)酶說(shuō)明書上一般是65度20min）然后直接向里面補(bǔ)第二個(gè)酶
或者*個(gè)切完后用氯仿抽提，把蛋白提出
或者中間做一次回收，這個(gè)就要考慮回收效率和損失的問(wèn)題了，但是這樣除蛋白zui*
前兩個(gè)方法我們這都是有人做過(guò)的，已經(jīng)都很好用了
33. 俺也來(lái)說(shuō)說(shuō)關(guān)于Bradford法蛋白濃度定量和DTNB法巰基濃度定量的一點(diǎn)體會(huì)：
我是做蛋白修飾巰基后，通過(guò)這兩種方法的定量來(lái)間接反應(yīng)修飾的程度。一路摸索過(guò)來(lái)，也有半年有余；zui大的體會(huì)就是不要急于求成，ELISA試劑盒直接實(shí)驗(yàn)，首先檢測(cè)修飾體系是否對(duì)方法有影響，修飾基團(tuán)是否會(huì)在595nm和412nm下有特定的吸收，修飾后修飾試劑本身是否會(huì)有變化，對(duì)蛋白整體結(jié)構(gòu)造成影響，其次再談具體修飾比例和程度。對(duì)于巰基濃度測(cè)定方法，有四種（Anal Biochem. 1998 Dec 1;265(1):8-14），而DTNB本身雖然靈敏度不高，但是重復(fù)性和抗干擾是*的了。
34. 考馬斯亮藍(lán)染色后的脫色，如在脫色液中加數(shù)張捏成條狀的Kimwipes紙（國(guó)外實(shí)驗(yàn)室常用，相當(dāng)我們的擦鏡紙，全棉纖維制造），由于染料吸附到紙纖維上，脫色加速。 待紙著色較深時(shí)，更換新紙條，不用換液。我想脫脂棉或紗布也是一樣的。但濾紙等可能不行，會(huì)溶掉。
半貼壁細(xì)胞如SP/0或雜交瘤細(xì)胞傳代時(shí)，不用吹打或刮落。先將上清吸出，適當(dāng)拍打培養(yǎng)瓶（當(dāng)然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了別找我），即可見貼壁細(xì)胞脫落，加培養(yǎng)基混懸即可。注意，過(guò)力拍打培養(yǎng)瓶會(huì)裂，特別是瓶頸。
