原代培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取出細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)，原代培養(yǎng)是建立細(xì)胞系的*步。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)原代培養(yǎng)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把*代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)，原代培養(yǎng)的細(xì)胞叫做細(xì)胞株，一般持續(xù)1～4周。

    細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程需要每天進(jìn)行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時(shí)了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞有無(wú)移動(dòng)、污染、培養(yǎng)基pH值是否變酸、培養(yǎng)基變黃是否需要更換等．細(xì)胞常規(guī)檢查觀察的方法有以下4種：

1)肉眼觀察

    一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察，主要看培養(yǎng)基的顏色和透明度的變換。正常情況下，培養(yǎng)基pH值介于7.2～7.4，呈桃紅色，清亮透明。細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中在恒溫箱培養(yǎng)時(shí)，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)會(huì)使培養(yǎng)基pH值下降，引起顏色變淺變黃。如不及時(shí)調(diào)節(jié)pH值，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞蛻變死亡。另外，如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基很快變黃，要注意是否有細(xì)菌污染或培養(yǎng)皿沒(méi)有洗干凈。也可在顯微鏡下仔細(xì)觀察有無(wú)污染。一般更換培養(yǎng)基的時(shí)間由營(yíng)養(yǎng)物的消耗而定，通常每周換液兩次，每次半換量或1/5—1／3量。若細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、死亡，則培養(yǎng)液顏色變紅或紫紅色，培養(yǎng)液pH值上升?？傊?，培養(yǎng)基顏色一旦出現(xiàn)變化，需要進(jìn)行換液培養(yǎng)。原代細(xì)胞*次換液培養(yǎng)時(shí)一定不要把原培養(yǎng)液全部倒掉，因?yàn)榕囵B(yǎng)液中帶有體細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能提升細(xì)胞體外存活率。

2顯微鏡觀察

    為保持原代細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，在培養(yǎng)過(guò)程中需要每天進(jìn)行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時(shí)了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)及培養(yǎng)基顏色的改變。生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。相差顯微鏡觀察時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞部分細(xì)微結(jié)構(gòu)c。若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，可見(jiàn)細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)酰?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。若細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良狀況沒(méi)有得到及時(shí)糾正，進(jìn)一步發(fā)展可見(jiàn)到部分細(xì)胞死亡．崩解漂浮在培養(yǎng)液中。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時(shí)處理，只有生長(zhǎng)良好的細(xì)胞才能進(jìn)行傳代培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)研究。

3)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

    細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)初代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)，都有一個(gè)長(zhǎng)短不同的潛伏期，在培養(yǎng)過(guò)程中注意觀察細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的狀態(tài)極為重要。各種細(xì)胞增殖的時(shí)間不盡相同，傳代細(xì)胞系、胚體組織和幼體細(xì)胞潛伏期短，一般在接種培養(yǎng)第2天即可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，3～4 d便可連接成片。成體組織、老年組織和癌組織潛伏期更長(zhǎng)，可達(dá)1周左右。原代細(xì)胞培養(yǎng)中zui先可見(jiàn)組織塊邊緣“長(zhǎng)出”細(xì)胞，這種細(xì)胞是從原代組織塊中游走出來(lái)的，并不是細(xì)胞增殖產(chǎn)生的。這種早期游離出的細(xì)胞多數(shù)是成纖維細(xì)胞，易生長(zhǎng)，適應(yīng)性強(qiáng)，呈放射狀或旋渦狀分布，很快生長(zhǎng)并互相連接成網(wǎng)狀。傳代細(xì)胞在傳代后，一般經(jīng)過(guò)懸浮、貼壁伸展很快進(jìn)入潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞大量繁殖、逐漸相連成片而長(zhǎng)滿瓶底。通常情況下，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞覆蓋瓶底的80％就應(yīng)及時(shí)傳代，否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致細(xì)胞脫落。當(dāng)發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)基變黃也應(yīng)及時(shí)傳代。

4)微生物污染的觀察

    細(xì)胞接種、傳代、換液加藥后應(yīng)經(jīng)常觀察，密切注意是否有微生物污染發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、液體內(nèi)漂浮著菌絲或細(xì)菌，或生長(zhǎng)明顯變緩，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)等應(yīng)懷疑是否有微生物污染，進(jìn)一步觀察檢查并及時(shí)處理。

(1)組織塊培養(yǎng)法

    將組織塊剪成小塊．去除不健康和壞死的部分，并用吸管吹打均勻，然后放到含有少量培養(yǎng)基的培養(yǎng)器瓶中(培養(yǎng)器皿根據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)需要做適當(dāng)處理，如在表面涂膠原薄層，以利于上皮細(xì)胞等的生長(zhǎng))，豎立放置培養(yǎng)瓶讓組織塊可以貼附到培養(yǎng)瓶的底部，然后放平培養(yǎng)瓶，細(xì)胞將沿瓶壁遷移增殖，使組織塊脫離培養(yǎng)基lO～15 min，然后用物理或化學(xué)的方法收集貼壁的細(xì)胞，移到另一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。該方法適合獲得組織比較少的情況時(shí)的培養(yǎng)：大多數(shù)細(xì)胞，在3 d以前就可以看到細(xì)胞的遷移，對(duì)于遷移快的細(xì)胞，會(huì)在組織塊周圍形戚“生長(zhǎng)暈”；遷移性不強(qiáng)的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，可能在3 d只有很少細(xì)胞會(huì)遷移。

(2)消化培養(yǎng)法

    將動(dòng)物*成小塊，放到無(wú)菌容器中，加入足夠體積的蛋白酶消化液(可以覆蓋整個(gè)容器底部，液面高過(guò)組織塊)，置于37℃環(huán)境中，每隔半個(gè)小時(shí)晃動(dòng)一次容器，直至組織塊消化*，或者將含有組織塊的消化液放到4℃冰箱中消化過(guò)夜。

(3)器官培養(yǎng)法

    將整個(gè)器官或者具有代表性的部分不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，并能存活，其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和。器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，它是保持相同類型或不同類型的細(xì)胞的原有的結(jié)構(gòu)關(guān)系以及由此產(chǎn)生相互作用，并觀察研究不同培養(yǎng)條件對(duì)器官組織的影響。器官培養(yǎng)分析主要依靠組織學(xué)的技術(shù)，不宜進(jìn)行生物化學(xué)和分子生物學(xué)分析。